馬成龍，劉波，黃柯冰

(1.漢中市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科；2.漢中市人民醫(yī)院麻醉科；3.漢中市中心醫(yī)院麻醉科，陜西 漢中 723000)

膿毒癥是機體經(jīng)嚴重創(chuàng)傷、燒傷、感染以及大手術(shù)后出現(xiàn)的全身炎癥性疾病，并常常伴隨多器官衰竭[1]。膿毒癥誘導(dǎo)的過度炎癥反應(yīng)、免疫抑制或過度組織損傷可增加對繼發(fā)感染的易感性[2]，因此，探討與膿毒癥誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)分子及機制至關(guān)重要。研究表明，長鏈非編碼RNA(lncRNAs)在炎癥反應(yīng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血管衰老和癌癥等發(fā)生發(fā)展中具有重要調(diào)控作用[3-4]，lncRNA IL-17R參與細菌內(nèi)毒素脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[5]，lncRNA HOTAIR促進LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠中TNF-α的產(chǎn)生[1]。LncRNA H19作為致癌基因，通過與miRNA相互作用促進癌癥的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[6-7]。H19可促進上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變，lncRNA H19可和miRNA相互作用，H19可能是水通道蛋白3(AQP3)上miRNA的一種競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)[8]，而此機制在免疫系統(tǒng)中起重要作用。然而，關(guān)于AQP、miRNA和H19的相互作用機制，及其在膿毒癥中的作用報道甚少。本研究旨在探討AQP1，miR-107和H19在LPS膿毒癥和炎癥反應(yīng)中的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 患者和血清樣本

經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，選取2017年1月至2018年1月漢中市人民醫(yī)院收治的15例膿毒癥患者作為膿毒癥患者組，其中女性6例，男性9例，平均年齡(69.3±9.7)歲。所有膿毒癥患者均經(jīng)臨床及體液病原體培養(yǎng)確診。選取同期同醫(yī)院的健康體檢者15名為健康對照組，其中男性10名，女性5名，平均年齡(61.2±10.4)歲。所有受試者均簽訂知情同意書。膿毒癥患者于確診后第2天采取空腹靜脈血，離心后收集血漿和血清樣本以備后續(xù)實時定量PCR和ELISA分析。

1.2 細胞培養(yǎng)及LPS干預(yù)

人293T細胞系購自美國ATCC公司。將細胞培養(yǎng)在含有10%的胎牛血清(美國Sigma公司)的DMEM培養(yǎng)基(美國Sigma公司)中，在37 ℃、5%CO2的條件下預(yù)培養(yǎng)24 h。對一部分細胞進行LPS干預(yù)，將細胞種植于6孔板并培養(yǎng)48 h后，于培養(yǎng)基中添加1 g/mL的LPS，對照組添加生理鹽水，相同條件下培養(yǎng)12 h。收獲細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

嚴格按照說明書進行操作，構(gòu)建pcDNA3.1/H19過表達質(zhì)粒。采用脂質(zhì)體3000(美國Invitrogen公司)將pcDNA3.1/H19(pc-H19)與其陰性對照(pc-NC)轉(zhuǎn)染入LPS誘導(dǎo)的293T細胞中。轉(zhuǎn)染后48 h收集細胞，實時定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4 實時定量PCR

按照說明書，采用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)從血漿樣本或者細胞中分離總RNA。隨后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix(美國Invitrogen公司)檢測mRNA的表達。2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。Primer Designing Tool在線軟件設(shè)計引物，見表1。

表1 引物設(shè)計

1.5 ELISA檢測

按照說明書，采用TNF-α、IL-1β和IL-6的ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)公司)檢測血清樣本和細胞中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。

1.6 熒光素酶報告分析

采用Diana LncBase (www.microrna.gr/LncBase)和StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)在線預(yù)測軟件預(yù)測lncRNA靶向miRNA。采用TargetScan (http://www.targetscan.org/)和miRDB (http://mirdb.org) 在線預(yù)測軟件預(yù)測miRNA靶基因。采用雙熒光素酶報告分析試劑盒(美國Promega公司)檢測lncRNA H19-miR-107-AQP1級聯(lián)反應(yīng)的相互作用。采用脂質(zhì)體3000(美國Invitrogen公司)將miR-107類似物及其陰性對照(miR-NC)、H19-wt/mut、pc-H19與其陰性對照(pc-NC)、Pgl3-AQP1-3′-UTR-wt轉(zhuǎn)染入人293T細胞中，轉(zhuǎn)染后48 h檢測熒光素酶活性。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血漿H19、miR-107和AQP1的表達比較

取健康對照組血漿H19、miR-107和AQP1的mRNA的相對表達值為1，膿毒癥患者組血漿中H19，miR-107和miR-107的相對表達則分別為(0.234±0.035)、(2.906±0.151)和(0.419±0.045)，兩組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，H19與miR-107的表達呈負相關(guān)(r2=0.757 2，圖1A)，H19和AQP1的表達呈正相關(guān)(r2=0.839 5，圖1B)，miR-107和AQP1的表達呈負相關(guān)(r2=0.760 4，圖1C)，見圖1。

2.2 血清促炎因子比較

與健康對照組比較，TNF-α、IL-6和IL-1在膿毒癥患者血清中的水平顯著升高(均P<0.01)，見表2。

表2 兩組血清中TNF-α、IL-6和IL-1水平比較(pg/mg)

*P<0.01，與健康體檢者比較。

2.3 體外研究lncRNA H19對LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的調(diào)控

與空白對照組相比，LPS降低H19和AQP1的表達(均P<0.05)，增加miR-107的表達(P<0.01)，提高促炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1的水平(均P<0.01)。與pc-NC轉(zhuǎn)染入LPS誘導(dǎo)的293T細胞組對比，pc-H19增加LPS誘導(dǎo)的H19和AQP1的表達(P值均<0.01)，降低LPS誘導(dǎo)的miR-107的表達(P<0.01)，降低LPS誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6和IL-1的水平(均P<0.01)，見圖2。

2.4 H19-miR-107-AQP1級聯(lián)反應(yīng)的相互作用

經(jīng)lncRNA靶向miRNA在線軟件預(yù)測分析，lncRNA H19與miR-107有2個結(jié)合位點(圖3A中只列出一個)，且熒光素酶報告分析顯示，miR-107與lncRNA H19 wt結(jié)合時的熒光素酶活性顯著低于miR-107與lncRNA H19 mut結(jié)合時(P<0.01)。與單獨轉(zhuǎn)染AQP1-3’UTR相比，AQP1-3’UTR和miR-107共轉(zhuǎn)染顯著抑制熒光素酶活性(P<0.01)。在AQP1-3’UTR和miR-107共轉(zhuǎn)染的細胞中，同時轉(zhuǎn)染入pc-NC對熒光素酶的活性無影響，但是轉(zhuǎn)染入pc-H19可顯著提高熒光素酶的活性(P<0.05)，見圖3-圖4。

3 討論

本研究采用臨床樣品和體外細胞模型研究LncRNA H19在膿毒癥炎癥反應(yīng)中的表達和作用機制。實驗證實膿毒癥患者血漿中H19表達減少，并伴有miR-107表達上調(diào)和AQP1表達下調(diào)，以及血清促炎癥因子釋放增加。在LPS誘導(dǎo)的人293T細胞中檢測到類似的結(jié)果。然而，H19過表達顯著逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的miR-107和AQP1表達失調(diào)，下調(diào)LPS誘導(dǎo)的促炎癥因子的水平。

由于膿毒癥常常伴隨多器官衰竭以及炎癥反應(yīng)失調(diào)，因此探討miR-107在炎癥反應(yīng)中的作用有助于了解膿毒癥的發(fā)病機制[9]，可為膿毒癥的預(yù)防和治療提供新思路。研究表明，miR-107在LPS的小鼠血液樣本中上調(diào)[10]，且其抑制劑可下調(diào)感染性急性腎損傷患者原代循環(huán)內(nèi)皮細胞中TNF-水平[11]，提示miR-107在膿毒癥誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起調(diào)節(jié)作用。研究證實miR-107及其預(yù)測的靶基因AQP1分別在膿毒癥患者血漿和LPS誘導(dǎo)的細胞中顯著上調(diào)和下調(diào)，在膿毒癥患者中顯示出明顯的負相關(guān)。AQP1在新生兒毒性紅斑、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及肺水腫引發(fā)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[12-14]，證明AQP1可調(diào)控炎癥反應(yīng)。臨床結(jié)果顯示，膿毒癥患者血清中TNF-α，IL-6和IL-1β的分泌顯著增高。結(jié)合體外研究，TNF-α，IL-6和IL-1β的分泌與miR-107表達有一致性，與AQP1的表達相反，提示miR-107可通過靶向AQP1促進炎癥反應(yīng)。而H19過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入LPS誘導(dǎo)的細胞后，AQP1表達增加，促炎因子水平降低，提示H19與miR-107拮抗性的調(diào)節(jié)AQP1表達和炎癥反應(yīng)，H19對膿毒癥誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的保護作用。

本研究通過預(yù)測并鑒定出AQP1是miR-107的直接靶標(biāo)之一。此外，AQP1在內(nèi)毒素休克引起的急性肺損傷中發(fā)揮重要作用，其可通過Wnt、MAPK、ERK1/2和NF-kB信號通路延緩腎囊腫、急性肺腦損傷[15-16]。本研究顯示，miR-107和AQP1表達、膿毒癥誘導(dǎo)的炎癥因子的分泌均受H19表達調(diào)節(jié)，提示H19、miR-107和AQP1在誘導(dǎo)和預(yù)防膿毒癥炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵作用。

研究表明，在膿毒癥調(diào)控中，H19和AQP1在與miR-107結(jié)合時存在競爭關(guān)系[17-18]。LncRNA H19是一種致癌基因，可促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，也常常作為miRNA海綿促進癌細胞增殖和癌癥發(fā)展[7，17-19]。研究已經(jīng)證實，lncRNA H19和miRNAs之間存在相互作用。在腸粘膜屏障功能中，H19可能是AQP3上miR-874的ceRNA[8]。研究中發(fā)現(xiàn)，H19可能也是AQP1上miR-107的ceRNA。H19表達可促進AQP1上調(diào)，而H19表達也可逆轉(zhuǎn)AQP1-3’UTR和miR-107共轉(zhuǎn)染的細胞中降低的熒光素酶活性，提示H19可能作為AQP1的ceRNA調(diào)節(jié)miR-107的表達。其他研究還表示，H19作為miRNA/RNA的ceRNA在疾病的發(fā)病機理中起重要作用[20-21]。這些結(jié)果表明H19作為分子海綿，可與miRNA/mRNA相互作用，調(diào)節(jié)膿毒癥的發(fā)生發(fā)展。

本研究的局限性在于，缺乏體內(nèi)和體外相關(guān)機制的探討，缺乏LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、AQP1，H19和miR-107表達的信號通路的探討。但本研究也證實H19對膿毒癥炎癥反應(yīng)的保護作用及AQP1，H19和miR-107三者的相互作用。

總之，在膿毒癥患者、LPS誘導(dǎo)的細胞中H19和AQP1表達降低，miR-107表達增加且與其呈負相關(guān)。促炎因子TNF-α，IL-6和IL-1β在膿毒癥患者和LPS誘導(dǎo)的細胞中顯著升高。而H19過表達可逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的miR-107、AQP1及促炎因子的水平。H19為AQP1上miR-107的ceRNA。進一步的研究應(yīng)著重于探討其調(diào)控炎癥反應(yīng)的機制及信號通路，以及H19是否為膿毒癥和并發(fā)癥的潛在治療靶點。