袁曉擘，李世剛，張宏岐，，陳思才，柳蔚，，*

（1.三峽大學醫(yī)學院，湖北宜昌443002；2.三峽大學茶葉研究所，湖北宜昌443002）

酪氨酸酶與多種疾病密切相關(guān)，如人體皮膚色素障礙性疾病、黑色素瘤、帕金森病、神經(jīng)退行性疾病、白化病等[1-2]。酪氨酸酶抑制劑在醫(yī)療美容、食品保鮮、農(nóng)業(yè)害蟲防治、生物抗菌等行業(yè)中具有重要的應用價值[3]。研究表明，抑制氧自由基對酪氨酸酶的激活作用，是酪氨酸酶抑制劑的主要作用機制之一[4]。當體內(nèi)自由基產(chǎn)生過多，或抗氧化體系衰減時，機體自由基逐漸累積，自由基上的孤對電子能夠與細胞內(nèi)的大部分物質(zhì)發(fā)生化學反應，損害細胞功能，促進和參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。調(diào)節(jié)機體代謝、防治活性氧對機體侵害性疾病的新型抗氧化劑的開發(fā)，已成為現(xiàn)今的研究熱點之一。

植物次生代謝產(chǎn)物熊果苷、槲皮素、橙皮苷、柚皮素等均有酪氨酸酶抑制活性[5-6]，其中甘草提取物應用最廣[7]，但卻受限于植物資源和生態(tài)環(huán)境的限制。茶葉是天然的抗氧化劑，具有清除氧自由基、防治動脈粥樣硬化、預防老年癡呆、降低血脂血糖和體重并延緩衰老等功效[8]。金亮等[9]研究六大類19個知名茶葉的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)茶葉種類不同其抗氧化活性不同，相關(guān)性分析表明茶湯顏色、抗氧化活性與茶葉總酚含量呈正相關(guān)。

五峰土家族自治縣位于鄂西南邊陲，武陵山支脈地貌使其生產(chǎn)的五峰綠茶（wu-feng green tea，WGT）富有獨特的口感，素有“中國茶葉之鄉(xiāng)”的美稱。綠茶富含多酚類、氨基酸類、生物堿類、多糖類及其他微量元素和礦物質(zhì)等多種成分，經(jīng)常飲用不僅有提神醒腦、補充營養(yǎng)等作用，還具有抗菌抗病毒、抗三高及防癌抗突變等多種功效。本試驗采用ABTS法、DPPH法、對O2-·的清除能力、對三價鐵離子的還原能力來測定五峰綠茶提取物的抗氧化作用，為其應用及進一步研發(fā)提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

N-1001S-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀器：日本東京理化器械株式會社EYELA；InfiniteR200 Pro NanoQuant酶標儀：瑞士Tecan公司；Eppendorf Centrifuge 5804 R離心機：德國艾本德股份公司。

酪氨酸酶（酶活力≥1 000 U/mg）、左旋多巴（levodopa，L-DOPA）：美國 Sigma-Aldrich 公司；維生素 C（抗壞血酸）：天津市天力化學試劑有限公司；對1，1-二苯基-2-苦基肼 （1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2′-azino-bis（3-ethylbenzo-thiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS]：上海金穗生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、乙酸、高硫酸鉀、Tris-HCl、鄰苯三酚（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

五峰綠茶：湖北五峰白溢春茶業(yè)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 WGT粗提物制備

稱取綠茶250 g，粉碎后置于圓底燒瓶中，加入2 500 mL蒸餾水加熱回流1 h。提取3次，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至200 mL左右時水浴干燥，測得提取量為82.14 g（得率32.86%）。

1.2.2 DPPH自由基清除試驗

精確稱取DPPH固體3.95 mg，用95%乙醇充分溶解定容至10 mL制備為工作液。分別取DPPH工作液60 μL，與60 μL不同濃度的樣品溶液混合暗處靜置30分鐘后，517 nm測其吸光值，計算其清除率。試驗以95%乙醇為空白對照組，維生素C為陽性對照組[10]。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為等量95%乙醇代替DPPH溶液的吸光度；A0為等量95%乙醇代替樣品溶液的吸光度。

1.2.3 ABTS+自由基清除試驗

分別取ABTS（7.4 mmol/L）溶液和過硫酸鉀（2.6 mmol/L）溶液各0.2 mL充分混合，室溫避光靜置12 h，制備成ABTS+自由基儲備液。試驗時分別取ABTS+自由基儲備液、95%乙醇-樣品溶液各 80 μL，充分混合10 min，734 nm下測定吸光值。

式中：A1為樣品溶液的吸光度；A2為等量蒸餾水代替樣品溶液的吸光度。

1.2.4 鐵氰化鉀法測定五峰綠茶總提物的還原能力

取一系列不同濃度樣品溶液各100 μL，加入0.2 mol/L（pH 6.6）磷酸鹽緩沖液和1%鐵氰化鉀溶液各100 μL，50℃保溫20 min后急速冷卻，加入10%三氯乙酸 100 μL，3 000 r/min離心10 min獲得上清溶液。取上清液50 μL，加入蒸餾水和0.025%氯化鐵各50 μL，充分混勻，靜置10 min。測定700 nm處的吸光值，吸光值越大還原力越強。試驗以蒸餾水為空白對照組，維生素C為陽性對照組。

1.2.5 超氧陰離子清除能力的測定

向96孔板分別加入60μL的Tris-HCl（50mmol/L，pH 8.2） 溶液、30 μL的不同濃度樣品溶液和 15 μL的鄰苯三酚-HCl（3 mmol/L）溶液，混勻后25℃水浴5 min，加入10 μL的HCl（10 mol/L）終止反應，420 nm下檢測各濃度吸光度值。以蒸餾水為空白對照，以維生素C作為陽性對照組。每個樣品重復3次取均值，按公式計算清除率。

式中：A0為空白對照管吸光度；A1為待測管吸光度；A2為等量蒸餾水代替鄰苯三酚-HCl溶液的本底吸光度。

1.2.6 酪氨酸酶抑制率檢測

以磷酸緩沖液（25 mmol，pH 6.8）為溶劑，配置L-DOPA底物溶液0.1 mg/mL、酪氨酸酶溶液（50 U/mL）以及其他溶液。用陳景明[11]報道的方法，96孔板中設(shè)置200μL總反應體系，分別加入40μL底物溶液、80μL磷酸緩沖液、40 μL樣品溶液，混勻后加入40 μL酪氨酸酶溶液，于25℃溫孵10 min，490 nm下測定吸光度。

計算公式：酪氨酸酶抑制率/%=1-[（A1-A2）/（A3-A0）]× 100

式中：A1為樣品溶液吸光度；A2為等量蒸餾水代替酪氨酸酶溶液的吸光度；A3為為等量蒸餾水代替樣品溶液的吸光度；A0為等量蒸餾水代替樣品溶液和酪氨酸酶溶液的吸光度。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS20.0計算IC50值，采用GraphPad Prism 5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH自由基清除效果

DPPH自由基化學性質(zhì)較穩(wěn)定，其乙醇溶液為深紫色，在517 nm處有強吸收。綠茶抗氧化成分與DPPH自由基的單電子配對可使DPPH-乙醇溶液褪色，褪色程度與DPPH自由基接受的電子數(shù)量成正比關(guān)系。試驗結(jié)果如圖1所示。

圖1 五峰綠茶清除DPPH自由基能力Fig.1 The scavenging effects of WGT on DPPH free radical

由試驗結(jié)果可知，綠茶總提物具有劑量依賴性的DPPH自由基清除活性。在試驗濃度范圍內(nèi)，比較綠茶總提物和維生素C清除DPPH自由基的能力，IC50值分別為50.561 μg/mL和16.046 μg/mL，最大清除率分別為92.5%和95.6%。由此看出，綠茶總提物在DPPH自由基的最大清除率上和維生素C相近，但所需劑量是維生素C的3倍。

2.2 ABTS+自由基清除效果

ABTS+自由基被氧化后呈綠色溶液，在734 nm處有最大吸收峰。綠茶提取物抑制ABTS+自由基的氧化，氧化產(chǎn)物的減少與溶液顏色成正比關(guān)系。因而檢測溶液吸光度的改變，反映出綠茶提取物的抗氧化能力。試驗結(jié)果如圖2所示。

圖2 五峰綠茶清除ABTS+自由基能力Fig.2 The scavenging effects of WGT on ABTS+free radical

由試驗結(jié)果可知，綠茶總提物具有很強的ABTS自由基清除活性，具有一定的量效關(guān)系。在試驗濃度范圍內(nèi)，比較綠茶總提物和維生素C清除ABTS+自由基的能力，IC50值分別為 8.811 μg/mL 和 5.753 μg/mL，最大清除率分別為100.0%和99.7%。由此看出，綠茶總提物在DPPH自由基的最大清除率上和維生素C相近，且所需劑量與維生素C相近。

2.3 五峰綠茶總提物還原能力的測定

通常抗氧化劑具有還原能力，因而通過給出電子以清除自由基；還原能力越強，抗氧化能力越強。鐵氰化鉀（三價鐵）如被還原成為亞鐵氰化鉀（二價鐵），還原產(chǎn)物亞鐵氰化鉀能夠與三氯化鐵反應生成普魯士藍，在700 nm處有最大吸光度，該吸光度的高低即可反映綠茶提取物的還原能力。試驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 五峰綠茶的還原能力Fig.3 The Reducing power of WGT

由試驗結(jié)果可知，綠茶總提物具有很強的還原能力，具有一定的量效關(guān)系。在試驗濃度范圍內(nèi)，比較綠茶總提物和維生素C的還原能力，IC50值分別為87.548 μg/mL 和 7.832 μg/mL，最大清除率分別為96.3%和96.8%。由此看出，綠茶總提物的最大還原能力的和維生素C相近，但所需劑量是維生素C的12倍，相差較大。

2.4 超氧陰離子自由基（O2-·）清除效果

鄰苯三酚在pH 8.30的Tris-HCl中自發(fā)發(fā)生氧化反應，生成的O2-·在420 nm處產(chǎn)生吸收峰。通過檢測吸收峰的變化，反應五峰綠茶抑制鄰苯三酚自氧化的能力。試驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 五峰綠茶清除氧自由基能力Fig.4 The scavenging effects of WGT on superoxide anion free radical

由試驗結(jié)果可知，綠茶總提物具有超氧陰離子自由基清除能力，且具有一定的量效關(guān)系。在試驗濃度范圍內(nèi)，比較綠茶總提物和維生素C的O2-·清除能力，IC50值分別為 196.095 μg/mL 和 5.245 μg/mL，最大清除率分別為57.3%和97.6%。由此看出，綠茶總提物對超氧陰離子自由基的清除能力有限，和維生素C相比相差較大。

2.5 酪氨酸酶活性檢測

酪氨酸酶催化底物多巴產(chǎn)生多巴醌，再繼續(xù)氧化成的黑色素在475 nm波長有吸光度。以每分鐘增加0.001為一個酶活力單位。綠茶總提物具有抗氧化能力，因而可抑制該氧化反應減少黑色素的生成，使吸光度降低。試驗結(jié)果如圖5所示。

圖5 五峰綠茶抑制酪氨酸酶活性Fig.5 Inhibitory effects of WGT on tyrosinase activities

由試驗結(jié)果可知，五峰綠茶總提物對酪氨酸酶活性有一定的抑制作用，該作用呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，但其最大抑制率僅為36.259%，說明綠茶總提物對酪氨酸酶的抑制作用較弱。劉錦梅等[12]發(fā)現(xiàn)，嶗山綠茶、福建花茶、福建鐵觀音、云南普洱茶的醇提物能夠抑制土豆酪氨酸酶活性，其中嶗山綠茶對酪氨酸酶活性的抑制率為9.50%。但是嶗山綠茶抑制酪氨酸酶活性9.50%。本研究發(fā)現(xiàn)，五峰綠茶也具有酪氨酸酶活性抑制作用，較劉錦梅測試嶗山綠茶所得抑制率更高，可能是兩種茶葉中具有抑制酪氨酸酶活性的主要成分茶黃素含量不同所致[13]，也可能是因為酪氨酸酶來源不同所致，具體原因有待于進一步試驗研究。

3 結(jié)論

本試驗采用4種體外檢測體系研究五峰綠茶抗氧化能力，其活性順序為清除ABTS+自由基＞清除DPPH自由基＞還原能力＞清除超氧陰離子自由基。試驗結(jié)果證明，五峰綠茶在一定濃度范圍內(nèi)確實具有較好的劑量依賴性的體外抗氧化能力和酪氨酸酶抑制活性。然而對不同自由基的清除能力不同，特別是對超氧陰離子自由基的清除能力差強人意，可能是因各體系原理不同所致[14]。