陳 惠，胡 勇

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是多種心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，現(xiàn)已嚴(yán)重危害到人類(lèi)的健康［1］。 大量基礎(chǔ)和臨床研究表明［2］，動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，是血管壁對(duì)各種損傷的一種異常反應(yīng)，具有經(jīng)典炎癥變性、滲出及增生的特點(diǎn)。炎癥反應(yīng)貫穿動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病的各個(gè)階段，可能是多種致動(dòng)脈粥樣硬化因素致病機(jī)制的共同環(huán)節(jié)或通路。炎癥機(jī)制不但與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，而且與動(dòng)脈粥樣硬化的多種并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥類(lèi)型包括生物性炎癥、免疫性炎癥和化學(xué)性炎癥。動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病初期主要表現(xiàn)為急性滲出性炎癥，而在進(jìn)展期主要表現(xiàn)出慢性增生性炎癥的特點(diǎn)。炎癥反應(yīng)中涉及多種炎癥細(xì)胞、炎性細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)、黏附分子、趨化因子、生長(zhǎng)因子等。現(xiàn)已證明，多種抗動(dòng)脈粥樣硬化藥物具有抗炎作用，抗感染治療已成為防治動(dòng)脈粥樣硬化的一種新途徑。

花青素是一種存在于植物性食物中的具有生物活性的化合物，存在于植物的葉、莖、花和果實(shí)中，具有多種藥理作用。研究表明［3］，花青素具有抗氧化、清除自由基、抗炎等作用，花青素其有效成分對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞有顯著保護(hù)作用，從而防止和減輕相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的內(nèi)皮功能障礙。該研究以脂多糖（LPS）誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷作為模型，研究花青素對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 花青素，純度≥98%，購(gòu)自南京景竹生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 （HUVECs），購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

1.3 試劑 胎牛血清購(gòu)自四季青公司、含0.25%EDTA的胰酶和高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；MTT試劑盒購(gòu)自北京solaibio公司；乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型谷胱甘肽（GSH）試劑盒購(gòu)自南京建成生物公司；一氧化氮（NO）合酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒購(gòu)自上海研謹(jǐn)生物公司；IL-6、TNF-α （ELISA）試 劑 盒 （Beijing Cheng Lin Biological Technology）；二氫乙錠（ DHE，美國(guó) AAT Bioquest公司）；抗體TLR4，NF-κB購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技公司；HRP標(biāo)記II抗購(gòu)自美國(guó)Earthox公司；β-actin購(gòu)自美國(guó)SAB公司；ECL化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技公司。

1.4 儀器 TC2323型二氧化碳孵箱 （美國(guó)SheldonManufacturing公司），XD-101型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），79-1型磁力加熱攪拌器 （江蘇金壇中大儀器廠），Leica DM1000型熒光顯微鏡（德國(guó)Leica公司），BS-124S型電子天平（德國(guó)賽多利斯天平有限公司），DNM-9602G型酶標(biāo)分析儀（北京普朗新技術(shù)有限公司），流式細(xì)胞儀（美國(guó)伯樂(lè)），電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像儀（Bio-Rad公司）。

1.5 方 法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 復(fù)蘇HUVECs，培養(yǎng)在高糖DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%抗生素），在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80%左右的融合度時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組（只給予培養(yǎng)基）；模型組（培養(yǎng)基中加入1000 ng/ml脂多糖孵育24 h）；花青素組 ［培養(yǎng)基中分別先加入100，50，25（μg/ml）濃度的花青素孵育 12 h，再加入1000 ng/ml脂多糖孵育24 h］。

1.5.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs，0.25%胰蛋白酶消化，以 1×105個(gè)/ml為接種密度、每孔100 μl接種于96孔培養(yǎng)板中。按1.5.1的分組及給藥方法培養(yǎng)后，傾去培養(yǎng)液，每孔加入新鮮培養(yǎng)液 90 μl，MTT 10 μl（5 g/L），繼續(xù)培養(yǎng)4 h；然后棄上清，每孔加入100 μl DMSO，搖床震搖15 min，在酶標(biāo)儀492 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。根據(jù)每組細(xì)胞的OD值計(jì)算細(xì)胞活力。

1.5.3 DHE熒光探針檢測(cè)HUVECs中ROS的變化獲取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVECs并以1×105個(gè)/孔容量接種于6孔板中。分組及給藥同1.5.1，作用24 h后，棄去上清，用PBS洗3次，加入10 μmol/L的DHE，37℃孵育30 min，在熒光顯微鏡下觀察。使用Imge-pro plus 6軟件進(jìn)一步分析生產(chǎn)結(jié)果。結(jié)果以相對(duì)熒光強(qiáng)度的單位表示。

1.5.4 ELISA法檢測(cè)一氧化氮（NO）、TNF-α和IL-6的含量 收集各組細(xì)胞上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)細(xì)胞上清液一氧化氮（NO）、TNF-α和IL-6的含量，將試劑盒置于室溫平衡30 min，按照ELISA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，完畢后全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm讀取A，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)各標(biāo)本A算出相應(yīng)的濃度。

1.5.5 HUVECs抗氧化指標(biāo)測(cè)定 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清，利用比色法按照試劑盒說(shuō)明方法分別檢測(cè)各組細(xì)胞中LDH、MDA、SOD、GSH-PX含量變化。

1.5.6 免疫印跡法測(cè)定蛋白表達(dá) 按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理完各組細(xì)胞后，棄去上清，收集各組細(xì)胞，加入200 μl蛋白裂解液（含 1%PMSF），冰上反復(fù)吹打，4℃，12 000 g離心15 min，取上清，通過(guò)BCA法進(jìn)行蛋白定量。制備12%分離膠，5%濃縮膠，SDSPAGE電泳，上樣量為40 μg/20 μl。半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。3%BSA 室溫封閉 1.5 h。TLR4，NF-κB一抗（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜，TBST 洗膜 3 遍，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5000）室溫孵育1.5 h，再次TBST洗膜3遍，ECL化學(xué)發(fā)光顯影拍照，凝膠成像儀檢測(cè)。

1.5.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（±s）表示。在方差齊性條件下多組間比較采用單因（One-wayANOVA）分析，多組間的兩兩比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 花青素對(duì)脂多糖（LPS）作用后HUVECs活力的影響 MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組相比，模型組（脂多糖損傷組）活力顯著降低（P＜0．01）；與模型組（脂多糖損傷組）相比，花青素組細(xì)胞活力隨濃度梯度增高逐漸上升（P＜0．01）。花青素濃度從 100 μg/ml至150 μmol/L對(duì)細(xì)胞活力無(wú)明顯影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明花青素可以增強(qiáng)HUVECs的活力（表1）。

表1 花青素對(duì)細(xì)胞活力的影響（n=5，±s）

表1 花青素對(duì)細(xì)胞活力的影響（n=5，±s）

注：與脂多糖損傷組比較，＊P＜0．05，#P＜0．01。

分組 細(xì)胞活力（%）空白組（對(duì)照組）99．5±5．6#脂多糖損傷組（模型組）51．3±3．1花青素組（25 μg/ml）63．4±3．8＊花青素組（50 μg/ml）76．9±4．6#花青素組（100 μg/ml）88．5±5．1#花青素組（150 μg/ml）88．2±5．2

2.2 花青素對(duì)脂多糖（LPS）作用后HUVECs ROS的影響 DHE熒光探針檢測(cè)顯示，模型組（脂多糖損傷組）HUVECs產(chǎn)生大量ROS，明顯高于空白對(duì)照組（P＜0．01）。 而花青素組 ROS 含量逐漸降低（P＜0．01）。實(shí)驗(yàn)表明，花青素可以在脂多糖（LPS）作用后減少HUVECs中ROS的產(chǎn)生（表2）。

2.3 花青素對(duì)脂多糖（LPS）作用后HUVECs功能因子和炎性因子的影響 ELISA方法檢測(cè)花青素對(duì)脂多糖（LPS）作用后HUVECs培養(yǎng)上清液中NO、TNF－α和IL－6含量變化（表3）。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組 （脂多糖損傷組）HUVECs上清中NO含量顯著下降，TNF－α和IL－6含量顯著上升（P＜0．01）；而不同濃度花青素組細(xì)胞上清液中NO含量隨濃度梯度逐漸上升，TNF－α和IL－6含量逐漸下降，呈現(xiàn)一定的濃度依賴(lài)性保護(hù)作用（P＜0．01）。

表2 花青素對(duì)細(xì)胞ROS的影響（n=5，±s）

表2 花青素對(duì)細(xì)胞ROS的影響（n=5，±s）

注：與脂多糖損傷組比較，＊P＜0．05，#P＜0．01。

分組 ROS（MFI）空白組（對(duì)照組）52．6±6．7#脂多糖損傷組（模型組）223．8±29．4花青素組（25 μg/ml）165．3±24．1＊花青素組（50 μg/ml）101．5±13．4#花青素組（100 μg/ml）74．7±5．8#

表3 花青素對(duì)細(xì)胞功能因子和炎性因子的影響（n=5，±s）

表3 花青素對(duì)細(xì)胞功能因子和炎性因子的影響（n=5，±s）

注：與脂多糖損傷組比較，＊P＜0．05，#P＜0．01。

分組 NO（μmol/L） TNF－α（pg/ml） IL－6（pg/ml）空白組（對(duì)照組）87．5±8．3# 143．4±22．3# 53．5±13．7#脂多糖損傷組（模型組）35．3±14．6 377．9±25．4 164．1±23．2花青素組（25 μg/ml）51．7±13．2＊ 338．6±31．5＊ 143．7±20．5＊花青素組（50 μg/ml）62．3±7．1# 272．8±37．1# 104．3±16．1#花青素組（100 μg/ml）75．2±12．1# 196．1±19．8# 71．2±9．7#

2.4 花青素對(duì)脂多糖 （LPS）作用后HUVECs LDH、MDA、SOD和GSH-PX的影響 經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)（表4），與空白對(duì)照組相比，脂多糖損傷組LDH、MDA含量顯著增加，SOD、GSH－PX活性顯著下降（P＜0．01）；當(dāng)不同濃度花青素作用于脂多糖氧化損傷后的HUVECs時(shí)，各組LDH、MDA含量逐漸下降，SOD、GSH－PX 活性逐漸上升（P＜0．01）。

2.5 花青素對(duì)脂多糖（LPS）作用后TLR4，NF-κB蛋白表達(dá)的影響 Western blot分析顯示，模型組HUVECs細(xì)胞中 TLR4，NF－κB蛋白的表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組，而不同濃度的花青素組中以上2種蛋白表達(dá)逐漸降低（P＜0．01，表 5）。 因此，花青素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用與TLR4/NF－κB通路密切相關(guān)。

3 討 論

脂多糖是革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的主要成分，通過(guò)脂多糖結(jié)合蛋白（LBP）運(yùn)送后，與各類(lèi)細(xì)胞質(zhì)膜上的CD14結(jié)合，CD14與LPS-LBP復(fù)合體結(jié)合后，通過(guò)Toll樣受體4（TLR4）激活NF-κB信號(hào)通路。信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)致使炎癥細(xì)胞因子如IL-6和TNF-α的釋放［4］。

表4 花青素對(duì)細(xì)胞LDH、MDA、SOD和GSH-PX的影響（n=5，±s）

表4 花青素對(duì)細(xì)胞LDH、MDA、SOD和GSH-PX的影響（n=5，±s）

注：與脂多糖損傷組比較，＊P＜0．05，#P＜0．01。

分組 LDH（U/L）MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）GSH－PX（U/mg）空白組（對(duì)照組）233．5±44．7# 2．14±0．23# 35．8±2．7# 126．8±18．4#脂多糖損傷組（模型組）914．6±123．9 4．43±0．29 14．3±1．6 60．7±13．1花青素組（25 μg/ml）731．8±145．1＊ 3．65±0．48＊ 19．8±3．1＊ 82．4±16．7＊花青素組（50 μg/ml）583．2±162．3# 2．82±0．22# 24．7±4．5# 104．9±13．9#花青素組（100 μg/ml）314．5±208．5# 2．41±0．25# 30．4±1．9# 60．4±14．6#

表5 花青素對(duì)細(xì)胞TLR4，NF-κB蛋白表達(dá)的影響（n=5，±s）

表5 花青素對(duì)細(xì)胞TLR4，NF-κB蛋白表達(dá)的影響（n=5，±s）

注：與脂多糖損傷組比較，＊P＜0.05，#P＜0.01。

分組 TLR4/β-actin NF-κB/β-actin空白組（對(duì)照組）0.23±0.12# 0.32±0.19#脂多糖損傷組（模型組）1.01±0.17 1.14±0.25花青素組（25 μg/ml）0.78±0.19＊ 0.79±0.32＊花青素組（50 μg/ml）0.56±0.14# 0.61±0.13#花青素組（100 μg/ml）0.39±0.11# 0.45±0.16#

炎癥部位的血管內(nèi)皮細(xì)胞既是炎癥過(guò)程的參與者，也是炎癥過(guò)程的調(diào)節(jié)者［5］。長(zhǎng)期或者反復(fù)的暴露于心血管危險(xiǎn)因素，將會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性抗炎系統(tǒng)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。最終內(nèi)皮不僅喪失功能，而且也會(huì)失去其完整性，進(jìn)一步的衰老而脫落至循環(huán)系統(tǒng)。因此，修復(fù)損傷的內(nèi)皮細(xì)胞，對(duì)改善血管的功能起著至關(guān)重要的作用［6］。

ROS 是指 O－2、脂多糖（LPS）等活性氧簇，大量ROS能夠促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷及凋亡［7］。該實(shí)驗(yàn)中，脂多糖（LPS）能夠誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生過(guò)量ROS，直接影響細(xì)胞存活和功能；而花青素組能明顯降低ROS的產(chǎn)生發(fā)揮保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞作用。許多實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究表明，氧化應(yīng)激與動(dòng)脈粥樣硬化高危因素（如高血壓，高脂血癥，糖尿病，吸煙等）引起的內(nèi)皮細(xì)胞異常密切相關(guān)［8］。 LDH，MDA，SOD和GSH-PX可以反映HUVECs的抗氧化能力。氧化損傷后細(xì)胞膜的完整性可以通過(guò)LDH釋放量來(lái)反映。同時(shí)，作為脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，MDA可以反映人體氧自由基的代謝和自由基攻擊細(xì)胞的損傷程度。該實(shí)驗(yàn)中，模型組LDH和MDA升高，而不同濃度的花青素組LDH和MDA含量逐漸下降。證明花青素可以維持HUVECs細(xì)胞的完整性，減少氧化損傷。SOD和GSH-PX作為抗氧化酶能夠拮抗氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷，修復(fù)受損細(xì)胞，其活性可以反映機(jī)體的抗氧化能力。該實(shí)驗(yàn)中，模型組SOD和GSH-PX活性下降，而花青素組HUVECs的SOD和GSH-PX活性顯著增加，說(shuō)明花青素有助于恢復(fù)模型組的抗氧化能力血管內(nèi)皮細(xì)胞。該實(shí)驗(yàn)中，模型組HUVECs活力明顯下降，而花青素組能明顯提升了HUVECs活力。炎癥因子IL-6，TNF-α在動(dòng)脈粥樣硬化起始環(huán)節(jié)起著重要作用［1，9］，該實(shí)驗(yàn)中模型組IL-6，TNF-α含量明顯上升，而花青素組明顯降低了IL-6，TNF-α含量，說(shuō)明花青素具有明顯抗炎作用而發(fā)揮對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)。NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的重要舒血管物質(zhì)，能夠直接反映內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能的強(qiáng)弱［10］。該實(shí)驗(yàn)中模型組NO含量明顯下降，提示內(nèi)皮細(xì)胞分泌功能減弱，而花青素組明顯增加了NO含量，提示花青素恢復(fù)了脂多糖（LPS）損傷HUVEC正常分泌功能。

綜上所述，脂多糖（LPS）可導(dǎo)致HUVECs損傷，而花青素對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞具有直接保護(hù)作用，減少ROS導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，恢復(fù)HUVECs正常分泌功能，且部分可能通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮作用。深入研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞炎癥與動(dòng)脈粥樣硬化病理過(guò)程的關(guān)系及其具體分子機(jī)制，將有助于理解和完善動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，將內(nèi)皮細(xì)胞炎癥作為治療靶點(diǎn)，干預(yù)炎癥的信號(hào)途徑，為研發(fā)新藥物和基因治療提供理論基礎(chǔ)。