曹宇碩 錢雪琴 蔡金鳳 陳智瑾 趙洋洋 朱召芹 盧洪洲

(1.上海市公共衛(wèi)生臨床中心檢驗醫(yī)學(xué)科；2.上海市公共衛(wèi)生臨床中心感染與免疫科，上海 201508)

艾滋病 (Acquired Immune Deficiency Syndrome, AIDS),又稱為獲得性免疫缺陷綜合征,是因HIV 侵入機(jī)體,破壞CD4+淋巴細(xì)胞,引起細(xì)胞免疫嚴(yán)重缺陷，導(dǎo)致患者抵抗力降低，繼發(fā)內(nèi)源性及外源性感染、惡性腫瘤和神經(jīng)系統(tǒng)病變?yōu)樘卣鞯呐R床綜合征。AIDS患者合并感染常見真菌有莢膜組織胞漿菌、馬爾尼菲籃狀菌、念珠菌屬、隱球菌屬、耶氏肺孢子菌[1]。隱球菌的檢測方法主要有真菌培養(yǎng)、墨汁染色、隱球菌抗原檢測。我們回顧性分析了2017年1～12月本院收治的AIDS患者不同隱球菌檢測方法的結(jié)果，以期篩選出診斷AIDS合并隱球菌感染較好的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

標(biāo)本來源于2017年1～12月，本院收治并確診的1 049例艾滋病患者的血液和腦脊液。

1.2 主要試劑

VITEK 2 YST酵母菌鑒定卡為法國梅里埃生物公司生產(chǎn)，成人中和抗生素培養(yǎng)瓶為美國Becton,Dickinson and Company公司生產(chǎn)，血平板和沙氏培養(yǎng)基購自上海科華微生物試劑有限公司，新生隱球菌抗原試劑盒為美國IMMY公司生產(chǎn)，墨汁染液為珠海貝索生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

真菌培養(yǎng)和鑒定：抽取腦脊液標(biāo)本1～5 mL和全血標(biāo)本5～10 mL,分別注入BD FX需氧培養(yǎng)瓶，待儀器報警顯示陽性時，取出標(biāo)本，用注射器吸取少量標(biāo)本，分區(qū)劃線接種于血瓊脂平板和沙氏培養(yǎng)基，分別置于35℃和25℃孵育箱中培養(yǎng)12～24 h，用YST酵母菌生化鑒定卡對其進(jìn)行菌種鑒定。刮取培養(yǎng)基上真菌菌落，用0.45% NaCL 3 mL調(diào)成1.8～2.2 McF真菌懸液，借助VITEK 2鑒定儀，將菌液注入YST鑒定卡的微量生化孔中，鑒定儀通過比色或比濁自動判讀生化反應(yīng)結(jié)果，鑒定是否為新生隱球菌。

墨汁染色:將收集的腦脊液高速離心，3 000 g離心10 min，棄上清，沉淀約以5∶1比例與墨汁混勻鏡檢，在黑色背景下見到出芽或不出芽、大小不均的菌體和透亮的寬厚莢膜為陽性。

側(cè)向免疫層析法 (LFA)：常規(guī)方法收集腦脊液和全血樣本，1 000 g離心15 min，樣品無需預(yù)處理，于試管中滴入1滴標(biāo)本稀釋液，用微量加樣器取40 μL的腦脊液或血清加入試管中，隨后將隱球菌抗原檢測試紙條的白端沒入到混懸液，室溫孵育10 min后進(jìn)行結(jié)果判讀。判讀標(biāo)準(zhǔn)：對照區(qū)存在紅色條帶，檢測區(qū)無紅色條帶表明檢測結(jié)果為陰性；對照區(qū)存在紅色條帶，同時檢測區(qū)也存在紅色條帶表明檢測結(jié)果為陽性；對照區(qū)無紅色條帶存在，無論檢測區(qū)有無紅色條帶均表明此次檢測結(jié)果無效，應(yīng)查找原因。

統(tǒng)計學(xué)方法:統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P<0.05差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié) 果

2.1 腦脊液墨汁染色結(jié)果

328例AIDS患者腦脊液墨汁染色，59例陽性，陽性率為17.99%。

2.2 真菌培養(yǎng)結(jié)果

對688例AIDS患者血標(biāo)本進(jìn)行真菌培養(yǎng)，19例培養(yǎng)出新生隱球菌，陽性率為2.8%；對316例AIDS患者進(jìn)行腦脊液真菌培養(yǎng)，29例培養(yǎng)為新生隱球菌，真菌培養(yǎng)陽性率為9.18%；其中189例患者的血和腦脊液標(biāo)本均進(jìn)行了真菌培養(yǎng)，17例患者血標(biāo)本培養(yǎng)出新生隱球菌，陽性率為8.99%，腦脊液培養(yǎng)檢出新生隱球菌22例，陽性率為11.64%。腦脊液真菌培養(yǎng)陽性率高于血培養(yǎng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=0.71，P>0.05)。血與腦脊液標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果一致性具體見表1。

表1189例艾滋病患者血與腦脊液標(biāo)本培養(yǎng)結(jié)果一致性比較

Tab.1Comparison of the results of blood and cerebrospinal fluid culture in 189 AIDS patients

血液培養(yǎng)腦脊液培養(yǎng)陽性陰性合計陽性14317陰性8164172合計22167189

2.3 腦脊液培養(yǎng)隱球菌檢出率與墨汁染色結(jié)果一致性比較

313例患者同時做腦脊液墨汁染色和真菌培養(yǎng)，墨汁染色陽性57例，陽性率為18.21%；真菌培養(yǎng)陽性29例，陽性率為9.27%，腦脊液墨汁染色陽性率高于真菌培養(yǎng)陽性率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=10.57，P<0.01)，兩者一致性比較見表2。

表2313例艾滋病患者腦脊液培養(yǎng)與墨汁染色結(jié)果一致性比較

Tab.2Comparison of cerebrospinal fluid culture and ink staining results in 313 AIDS patients

腦脊液培養(yǎng)腦脊液墨汁染色陽性陰性合計陽性26329陰性31253284合計57256313

2.4 側(cè)向免疫層析法檢測結(jié)果

1 049例AIDS患者進(jìn)行側(cè)向免疫層析法檢測，陽性115例，陽性率為10.96%，其中956例患者血標(biāo)本側(cè)向免疫層析法檢測，陽性101例，陽性率為10.56%；294例患者腦脊液進(jìn)行側(cè)向免疫層析法檢測，70例陽性，陽性率為23.81%；201例患者同時做腦脊液和血側(cè)向免疫層析法檢測，腦脊液陽性56例，陽性率為27.86%，血陽性75例，陽性率37.31%，血側(cè)向免疫層析法檢測陽性率高于腦脊液，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=4.09，P<0.05)。兩種標(biāo)本聯(lián)合檢測一項或兩項陽性例數(shù)為76例，陽性率為37.81%。兩者一致性見表3。

表3201例艾滋病患者腦脊液和血標(biāo)本側(cè)向免疫層析法檢測結(jié)果一致性比較

Tab.3Comparison of the results of lateral immunochromatographic assay between cerebrospinal fluid and blood samples of 201 AIDS patients

腦脊液檢測血標(biāo)本檢測陽性陰性合計陽性55156陰性20125145合計75126201

2.5 腦脊液墨汁染色與側(cè)向免疫層析法檢測結(jié)果比較

292例AIDS患者同時做腦脊液墨汁染色和側(cè)向免疫層析法檢測，墨汁染色陽性57例，陽性率19.52%，腦脊液側(cè)向免疫層析法檢測陽性70例，陽性率為23.97%，腦脊液側(cè)向免疫層析法檢測陽性率大于墨汁染色法，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=1.70，P>0.05)。聯(lián)合檢測一項或兩項陽性例數(shù)為73例，陽性率為25%。詳見表4。3例墨汁染色陽性，腦脊液側(cè)向免疫層析法檢測陰性者，有2例血清側(cè)向免疫層析法檢測陽性，滴度分別為1∶2 560和1∶80。

表4292例艾滋病患者腦脊液墨汁染色與側(cè)向免疫層析法檢測結(jié)果一致性比較

Tab.4Comparison of the results of cerebrospinal fluid ink staining and lateral immunochromatography in 292 AIDS patients

腦脊液墨汁染色腦脊液側(cè)向免疫層析法檢測陽性陰性合計陽性54357陰性16219235合計70222292

2.6 血真菌培養(yǎng)與側(cè)向免疫層析法檢測結(jié)果一致性

338例AIDS患者同時做血真菌培養(yǎng)和側(cè)向免疫層析法檢測，血真菌培養(yǎng)新生隱球菌陽性5例，陽性率為1.48%；側(cè)向免疫層析法檢測陽性13例，陽性率為3.85%。側(cè)向免疫層析法檢測陽性率高于血真菌培養(yǎng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=3.65，P>0.05)。兩者聯(lián)合檢測一項或兩項陽性14例，陽性率為4.14%。兩者一致性比較具體見表5。

2.7 腦脊液真菌培養(yǎng)與側(cè)向免疫層析法檢測結(jié)果比較

284例AIDS患者同時做腦脊液培養(yǎng)與側(cè)向免疫層析法檢測，腦脊液真菌培養(yǎng)陽性25例，陽性率為8.80%；側(cè)向免疫層析法檢測陽性68例，陽性率為23.94%，側(cè)向免疫層析法檢測陽性率高于腦脊液培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=23.77，P<0.01)。兩者一致性具體見表6。

表5338例艾滋病患者血培養(yǎng)與血側(cè)向免疫層析法檢測結(jié)果一致性比較

Tab.5Comparison of the results of blood culture and blood lateral immunochromatographic assay in 338 patients with AIDS

血真菌培養(yǎng)血側(cè)向免疫層析法檢測陽性陰性合計陽性415陰性9324333合計13325338

表6284例艾滋病患者腦脊液培養(yǎng)與側(cè)向免疫層析法結(jié)果一致性比較

Tab.6Comparison of results of cerebrospinal fluid culture and lateral immunochromatography in 284 AIDS patients

腦脊液真菌培養(yǎng)腦脊液側(cè)向免疫層析法陽性陰性合計陽性24125陰性44215259合計68216284

3 討 論

有文獻(xiàn)報道發(fā)達(dá)國家AIDS患者未經(jīng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒之前，隱球菌播散性感染發(fā)生率為5%～8%[2]。本院收治的AIDS患者中，隱球菌播撒性感染率為10.56%稍高于文獻(xiàn)報道。

隱球菌感染檢測方法中，墨汁染色是最常用的方法，操作簡單，用時短，約需2 min，陽性率為54%～74%[3]。艾滋病合并隱球菌性腦膜炎患者，墨汁染色的敏感性為80%～85%[4]，可快速診斷隱球菌感染。其適用的標(biāo)本類型為無菌體液、尿液等，灌洗液、支氣管刷取物和少量痰加水漩渦振蕩后，取上清，也可進(jìn)行墨汁染色。體液標(biāo)本經(jīng)離心沉淀后再進(jìn)行墨汁染色，可提高陽性率。本院采用離心沉淀后墨汁染色，328例AIDS患者腦脊液隱球菌檢出率為17.99%。墨汁染色結(jié)果易受菌量多少、實驗室人員技術(shù)能力、墨汁質(zhì)量等影響，造成假陽性和假陰性結(jié)果出現(xiàn)。一般腦脊液和墨汁的比例為5∶1左右為宜，最好選用接種槍加墨汁和標(biāo)本，即取10 μL墨汁和50 μL腦脊液混勻，小心蓋上蓋玻片，避免產(chǎn)生氣泡，用筆輕壓，先低倍鏡觀察，以見到細(xì)小墨汁顆粒為找到視野，再觀察全片，低倍鏡下閱片不少于300個視野，當(dāng)黑色或棕色背景下看到無色的、很亮的暈圈，暈圈內(nèi)可見清晰圓形或橢圓形孢子，再轉(zhuǎn)高倍鏡確認(rèn)，隱球菌高倍鏡下可見到完整光滑細(xì)胞壁及胞內(nèi)脂質(zhì)顆粒。若低倍鏡下，僅看到漆黑，為墨汁量過多，可輕壓蓋玻片，用濾紙吸去多余染液再觀察，否則易造成假陰性結(jié)果。低倍鏡觀察時，要先將聚光鏡下調(diào)，光圈縮小，可觀察到隱球菌清晰的細(xì)胞壁。選擇顆粒細(xì)的墨汁為佳，根據(jù)墨汁不同，適當(dāng)調(diào)整腦脊液與墨汁的比例，可有效提高墨汁染色隱球菌的檢出率。墨汁染色時，紅酵母菌和白吉利毛孢子菌可造成假陽性結(jié)果。有文獻(xiàn)報道將阿利新藍(lán)染色用于腦脊液隱球菌的檢測，檢出陽性率也可達(dá)80%～90%[5]，隱球菌經(jīng)阿利新藍(lán)染色后，莢膜可被染成深藍(lán)色，菌體呈淡藍(lán)色，而周圍的炎性細(xì)胞不著色，染色對比清晰，當(dāng)隱球菌數(shù)目少時也容易觀察，較傳統(tǒng)墨汁染色隱球菌檢出率高，有條件的實驗室可考慮使用。

真菌培養(yǎng)是通過對標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定，判斷患者是否發(fā)生隱球菌感染，一般需要28℃和35℃培養(yǎng)3～4 d,個別新生隱球菌需要延長培養(yǎng)時間到1周以上，為現(xiàn)階段臨床檢查新生隱球菌的金標(biāo)準(zhǔn)，與涂片和隱球菌抗原檢測相比，培養(yǎng)時間長，不利于患者病情的早期診斷。據(jù)文獻(xiàn)報道[4]合并感染隱球菌腦膜炎的艾滋病患者，其腦脊液和血標(biāo)本真菌培養(yǎng)的敏感性分別為90%和50%～70%，其中腦脊液培養(yǎng)敏感性隨著標(biāo)本量增加而增高 (10 μL時為82%，100 μL時94%)。本院688例AIDS患者血標(biāo)本真菌培養(yǎng),新生隱球菌的檢出率為2.8%，與吳開進(jìn)[6]報道的2.3% (6/259)血真菌培養(yǎng)陽性率相近。316例AIDS患者腦脊液真菌培養(yǎng)陽性率為8.2%。313例患者同時做了腦脊液墨汁染色和真菌培養(yǎng)，墨汁染色陽性率為18.21%；培養(yǎng)陽性率為9.27%，腦脊液墨汁染色陽性率高于真菌培養(yǎng)陽性率。由于本實驗室血液及無菌體液真菌增菌培養(yǎng)使用的是一般菌需氧培養(yǎng)瓶，而未使用真菌專用培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)條件為35℃，5 d，部分隱球菌可能由于培養(yǎng)時間短而漏檢；有部分患者由于已接受過抗真菌預(yù)防治療，菌已死而抗原存在，出現(xiàn)墨汁染色陽性而培養(yǎng)陰性。本院真菌培養(yǎng)陽性菌株，經(jīng)VITEK 2系統(tǒng)鑒定，均為新生隱球菌，有文獻(xiàn)報道[7]，API 20C系統(tǒng)、Vitek全自動微生物鑒定儀或MicroScan全自動微生物鑒定系統(tǒng)等，目前尚無法區(qū)分新生隱球菌及格特隱球菌，德國布魯克公司的MALDI TOF MS不僅能準(zhǔn)確區(qū)分格特隱球菌和新生隱球菌，還可進(jìn)行分子分型。

隱球菌抗原 (CrAg)檢測具有很高的敏感性及特異性，可在癥狀出現(xiàn)之前檢測到。目前常用的檢測方法有3種，分別是乳膠凝集法 (LA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)和側(cè)向免疫層析法 (LFA)。3種方法均利于患者病情的早期診斷，監(jiān)測隱球菌抗原滴度的下降，可作為抗隱球菌療法有效的指示。據(jù)文獻(xiàn)報道[4]以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，LA在血標(biāo)本和腦脊液的敏感性分別為83%～97%和93%～100%，特異性分別為93%～100%和93%～98%。ELISA法敏感度高于LA法，其檢測血標(biāo)本的敏感性和特異性分別為94%和96%，檢測腦脊液的敏感性和特異性分別為100%和98%，但操作繁瑣，需要配置額外設(shè)施，對新生隱球菌 (血清型D)和格特隱球菌 (血清型C)檢測敏感性低。LA具有檢測需要時間短，操作方便，其局限性為結(jié)果判讀受人為因素影響較大，需要對標(biāo)本進(jìn)行前處理，對格特隱球菌 (血清型C)敏感性低。ELISA法和LA法試驗的假陽性率為0.0%～0.4%[7]。本文采用的是LFA法，該方法是IMMY公司繼乳膠凝集法后新研發(fā)的試劑盒，其在常溫狀態(tài)下性質(zhì)穩(wěn)定，操作簡便且耗時短 (10 min)，對結(jié)果的判定簡單、準(zhǔn)確，標(biāo)本不需前處理，敏感性高于LA法和ELISA法[8]。對所有血清型新生隱球菌和格特隱球菌均有很高的敏感性。有文獻(xiàn)報道LFA對隱球菌病的診斷敏感性和特異性可達(dá)到100%，特別是檢測低濃度的莢膜抗原方面，與LA相比具有更高的敏感性[9]。本文中1 049例AIDS患者進(jìn)行LFA法檢測，陽性率為10.96%；201例同時做腦脊液和血標(biāo)本的LFA法檢測，腦脊液陽性56例，陽性率為27.86%，血標(biāo)本陽性75例，陽性率37.31%，有文獻(xiàn)報道當(dāng)CSF中隱球菌莢膜抗原檢測為陽性時，血液中檢測其敏感性可達(dá)99%，應(yīng)用LFA檢測指尖血、血清、血漿和腦脊液，CrAg的結(jié)果一致性100%[10]，說明檢測指尖血CrAg簡單可行性；應(yīng)用LFA檢測尿液及唾液中CrAg的效果差，有待進(jìn)一步研究[11]。對于3例墨汁染色陽性，腦脊液LFA法檢測陰性者，其中2例血清LFA法檢測陽性，具體原因待研究。

總之，通過回顧性分析2017年本院收治的AIDS患者標(biāo)本，用3種方法檢測隱球菌的陽性率，以血培養(yǎng)陽性率最低，腦脊液標(biāo)本墨汁染色與LFA法檢測陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，血標(biāo)本LFA法檢出率最高，可作為AIDS患者合并隱球菌感染較理想的早期診斷方法。