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歷史上，鶴慶縣于1772年、1778-1796年、1879-1888年在東區(qū)有過3次較大的鼠疫流行。1985年在鶴慶縣草海鎮(zhèn)的馬廠村、 新峰村的狗血清和鼠血清中發(fā)現(xiàn)鼠疫抗體放射免疫陽性4份[1]，1990年后開始每月在新峰、馬村進行鼠疫監(jiān)測，但一直未發(fā)現(xiàn)鼠疫更多線索。直至2017年4月，鶴慶縣疾病預防控制中心鼠防人員在草海鎮(zhèn)馬廠村進行鼠疫常規(guī)監(jiān)測時，發(fā)現(xiàn)鼠疫菌陽性，并在隨后的擴大調(diào)查中，陸續(xù)從活鼠中分離到10余株鼠疫菌株，從而確定馬廠村發(fā)生鼠間鼠疫流行[2]，鶴慶縣也正式成為建國后云南省的新發(fā)野鼠鼠疫疫源地。

鼠疫噬菌體一直被用來進行鼠疫病原體的鑒定[3]，在自然界中與鼠疫菌存在競爭和共進化的復雜關(guān)系。只要有鼠疫菌存在的地方就有鼠疫噬菌體的蹤跡[4]，那么作為新發(fā)疫源地，鶴慶鼠疫疫源地內(nèi)是否也存在著鼠疫噬菌體，其分布率如何，生物學特性如何，一系列的疑問的回答是更深入了解此疫源地的有益線索，是做好此塊疫源地鼠疫防控工作的基礎工作。本研究就此進行了調(diào)查研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1樣本采集 采樣主要以鶴慶縣草海鎮(zhèn)馬廠村為中心向周圍5 km范圍調(diào)查采樣，包括鶴慶縣草海鎮(zhèn)的馬廠、小馬廠、黑泥紹及安樂等4個自然村。采用鼠鋏法(5 m鋏線法)捕獲老鼠，于實驗室中無菌剖解，并在無菌條件下取鼠腸道2cm左右，立即放入置有5 mL 改良PBS增菌液(Fluka，peptone sorbitol bile brother)的離心管中，于4 ℃冰箱中保存待檢。

1.2噬菌體分離宿主菌EV76的活化 本實驗以鼠疫菌株EV76作為噬菌體分離的宿主菌。從-80 ℃冰箱中取出含株保存的EV76疫苗株(本實驗室保存)，接種于含1%的兔溶血LB平皿上， 28 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h，挑取單個菌落，在LB平皿上三道劃線，28 ℃溫箱培養(yǎng)48 h，挑取單菌落進行增殖備用。

1.3鼠疫噬菌體的分離與純化 采用雙層平板法進行噬菌體的分離純化，具體為：將上述樣本經(jīng)0.22 μm濾膜(美國Millipore)過濾，并加入到含有對數(shù)生長期EV76菌懸液100 μL的15 mL離心管中，置恒溫氣浴振蕩培養(yǎng)箱28 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)24 h；再次過濾增殖液，并取300 μL與150 μLEV76菌懸液充分混勻，然后加入到6 mL的半固體培養(yǎng)液(50 ℃)中，混勻鋪板；待半固體凝固后分別置于28 ℃和37 ℃溫箱中培養(yǎng)24 h。如若有噬菌斑出現(xiàn)，該樣本則為陽性樣本，從雙層平皿上挑取生長狀況良好的單個菌斑進行增殖培養(yǎng)。6次單斑增殖后平皿上可見形態(tài)大小一致的噬菌斑，將其視為純化好的噬菌體[5]。

1.4噬菌體的電鏡觀察 取2 mL純化好的噬菌體樣本和1 mL的宿主EV76混勻加入到有6 mL液體培養(yǎng)基的增菌管中，放入空氣搖床28 ℃，220 r/min，培養(yǎng)24 h。取出增殖液0.22 μm濾膜過濾，加入EV762 mL繼續(xù)培養(yǎng)，如此重復3次，得到濃縮后的噬菌體菌液，取20 μL(噬菌體效價為1×108)滴于石蠟片上，采用醋酸雙氧鈾染色，置于銅網(wǎng)上進行電鏡(日立HT7700)觀察。

1.5噬菌體不同溫度下裂解譜觀察 溫度設定：通過預實驗選取24 ℃、28 ℃、37 ℃作為本研究的實驗溫度。受試菌株的選擇：選用21株鼠疫分離株分別是：鶴慶(10株)、麗江(3株)、劍川(3株)、以及云南家鼠鼠疫菌株(4株)。非鼠疫菌株115株來自于：云南省地方病防治研究所保存的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(20株)，其余95株不同種屬菌株由大理市第一人民醫(yī)院以及大理州醫(yī)院提供。

1.6實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法 采用Photoshopcs3進行噬菌體電鏡照片中噬菌體大小的測量，以及Microsoft Excel進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計整理，采用SAS 9.4進行卡方分析，P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1分離情況 此次調(diào)查共采集成年活鼠標本共354份，經(jīng)篩查共檢出鼠疫噬菌體陽性樣本2份，陽性率為0.56%。4個采樣自然村中只有馬廠村分離到了2株鼠疫噬菌體，其余小馬廠、黑泥紹及安樂村未分離到鼠疫噬菌體，經(jīng)檢驗4個自然村噬菌體分離率差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.706，P>0.05)，見表1。從宿主動物上看：共有大絨鼠、齊氏姬鼠、社鼠、臭鼩鼱及黃胸鼠5種，大絨鼠占72.60%，但從中未分離到鼠疫噬菌體，2兩株噬菌體分別分離自齊氏姬鼠及臭鼩鼱，詳見表2。經(jīng)檢驗5種宿主動物之間噬菌體分離率的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=23.91，P<0.05)。采用分割法兩兩比較，臭鼩鼱分離率高于其他宿主動物。

2.2所分離到兩株噬菌體的噬菌斑形態(tài) 分離到的兩株噬菌體命名為HQ1和HQ2。剛分離出的噬菌體生長狀態(tài)較差，經(jīng)過6次純化增值后，在28 ℃和37 ℃條件下培養(yǎng)24 h在雙層瓊脂平板上形成圓形、透明、邊緣清晰的噬菌體，28 ℃條件下直徑為1～1.5 mm，37 ℃條件下噬菌斑直徑增大到2～3 mm(圖1)。

2.3噬菌體電鏡形態(tài) 醋酸雙氧鈾負染后在電子顯微鏡下觀察，鶴慶分離的兩株鼠疫耶爾森噬菌體的形態(tài)如HQ1噬菌體頭部呈正六面體結(jié)構(gòu)，頭部直徑約45.42 nm，尾部長約108.17 nm; HQ2噬菌體頭部也呈正六面體結(jié)構(gòu)，頭部直徑約37.88 nm,尾部長約121.85 nm(圖2)。兩株噬菌體的電鏡形態(tài)顯示，噬菌體含非收縮性尾部，根據(jù)2011年國際病毒分類委員會第9次報告提出的噬菌體分類與命名標準，兩株噬菌體符合肌尾噬菌體科特征[6]。

表1 鶴慶縣草海鎮(zhèn)4個自然村噬菌體分離情況Tab.1 Phage separation in 4 natural villages in Caohai Town, Heqing

表2 鶴慶縣草海鎮(zhèn)不同宿主動物鼠疫噬菌體的分離情況Tab.2 Isolation of plague phage from different host animals in Caohai Town, Heqing

A：HQ1在28 ℃下對EV76的噬菌斑；B：HQ2在28 ℃下對EV76的噬菌斑；C：HQ1在37 ℃下對EV76的噬菌斑；D：HQ2在37 ℃下對EV76的噬菌斑。圖1 鶴慶縣2株鼠疫噬菌體不同溫度下噬菌斑圖Fig.1 Plaque pattern of two plague phage in Heqing at different temperatures

圖2 鶴慶縣2株鼠疫噬菌體電鏡形態(tài)Fig.2 Electron microscopic morphology of two plague phage in Heqing

2.4噬菌體不同溫度下裂解特性測定 所分離2株鼠疫噬菌體對于21株鼠疫菌(包括EV76)的裂解特性相同，即22 ℃與24 ℃下不裂解，28 ℃與37 ℃裂解，且37 ℃下的裂解性較28 ℃要強。對于115株非鼠疫菌，兩株噬菌體對在22 ℃、24 ℃、28 ℃和37 ℃狀態(tài)下均不裂解。該結(jié)果進一步表明，所分離的噬菌體為鼠疫噬菌體。詳見表3與圖3。

1代表診斷噬菌體，2代表HQ1，3代表HQ2圖3 鶴慶縣2株鼠疫噬菌體不同溫度下裂解鼠疫菌圖Fig.3 Analysis of plague plaques from two plague phage of Heqing at different temperatures

表3 不同溫度下鶴慶噬菌體對136株受試菌株的裂解情況Fig.3 Lysis of 136 strains of Heqing phage at different temperatures

“-”表示未裂解，“+”表示裂解

3 討 論

3.1鶴慶新發(fā)鼠疫疫源地中存在著鼠疫噬菌體 2017年4月，云南省鶴慶縣從捕獲的350多份活鼠(及其寄生蚤)中分離到10株鼠疫菌，并證實這些鼠疫菌株與麗江野鼠鼠疫疫源地菌株具有很高的同源性，鶴慶疫情可能是麗江鼠疫進一步向南擴散的結(jié)果[7]。從1772至1937年間，鶴慶縣流行鼠疫50年次，累計死亡15 000人，此后再也沒有疫情報道[1]，1937到2017年過去了80年。2017年又監(jiān)測到鼠間疫情，且從活鼠中檢出鼠疫菌，分離率近3%，這說明鼠疫在這一地區(qū)一直存在，一個古老而又未解的疑問又提出來了，鼠疫菌在這一地區(qū)又是怎樣保存的，鼠疫菌的微生態(tài)研究也許是揭開這一迷團的一把鑰匙，其中鼠疫噬菌體在鼠疫微生態(tài)學研究中扮演了十分重要的角色。

本研究證實，在這一古老的新發(fā)鼠疫疫源地中確實存在著鼠疫噬菌體，而噬菌體的分離地與鼠疫菌的分離地都是在馬廠村，這更說明了鼠疫菌與鼠疫噬菌體相輔而存、協(xié)同進化的關(guān)系。從分離宿主上看，雖然大絨鼠疫是此地占絕對優(yōu)勢的鼠種，但并未從其體內(nèi)分離到鼠疫噬菌體，而在分布較少的齊氏姬鼠上則分離到一株鼠疫噬菌體，這與齊氏姬鼠在野鼠疫源地中對鼠疫菌為高感受性、低敏感性及中等抗性，這與鼠疫菌的貯存宿主[8]的研究相對應，也間接印證了其在疫源地中充當鼠疫菌貯存宿主的這一角色。

3.2鶴慶分離鼠疫噬菌體特殊的裂解溫度依賴性及其生物學意義 此次分離到的兩株鼠疫噬菌體剛分離時生長狀態(tài)較差，經(jīng)純化和傳代培養(yǎng)后生長狀態(tài)明顯改善。純化后經(jīng)測定得到其最適生長溫度為37 ℃，而鼠疫診斷噬菌體最適裂解溫度在25～28 ℃[9]。鶴慶分離噬菌斑與李存香等分離自玉龍，劍川等地噬菌體在生長狀態(tài)、噬菌斑直徑、最適生長溫度等方面均存在一定差異[10-11]。此次分離的兩株噬菌體只有在28～37 ℃溫度范圍內(nèi)對鼠疫菌有較強的裂解特性，低于25 ℃下不裂解鼠疫菌。這種特性，使其與鼠疫菌在自然條件下(馬廠村位于鶴慶縣草海鎮(zhèn)西山，距縣城35 km，海拔2 980 m，年平均氣溫13.5 ℃，年降水量900 mm)可以共存活，而在動物體內(nèi)(37 ℃)該噬菌體則可裂解鼠疫菌。這樣的特性既保證了鼠疫菌在自然界中(如鼠巢、土壤中)的存留，又不至于使鼠疫菌在動物間廣泛傳播形成大的流行。

2017年4月鶴慶發(fā)生了鼠間鼠疫流行，一種推測可能是：由于長期的鼠疫較低流行，使鼠疫噬菌體在這一地方的豐盛度大大降低，從而感染鼠疫的宿主動物能同時接觸到此種噬菌體的概率就降低，因而鼠疫菌在動物體內(nèi)失去了“天敵”，繼而鼠疫又流行起來。隨著動物間鼠疫的大流行后，鼠疫噬菌體的豐盛度又會增加，繼而鼠疫的流行又會被鼠疫噬菌體抑制而逐漸減弱。同時噬菌體作為一類裂解性殺菌病毒，有嚴格的宿主特異性，對人和動物均無害[12]，因此從鼠疫生物防控的角度，只要在這一地方投放含有這種鼠疫噬菌體的老鼠餌料，從而增加鼠疫噬菌體在這一地區(qū)宿主動物中的豐盛度，自然會降低鼠疫動物間流行的風險，從而降低涉及到人的可能；同時采用這種屬地分離鼠疫噬菌體進行投放，對當?shù)卣麄€微生態(tài)的影響更小，更為安全可靠，不至于造成外源噬菌體(如診斷用噬菌體)對鼠疫菌及其生態(tài)帶來不可預測的風險。

當然，是什么機制導致對這兩株鼠疫噬菌體具有如此獨特的溫度依賴性裂解鼠疫菌的特性，仍是我們所未知的。隨著我們對這兩株鼠疫噬菌體測序的完成，更多生物學指標的測定，我們將逐步揭開此神秘的面紗。而這些問題的解決，對于我們認識鼠疫保存機制，進而制定更科學的鼠疫防控策略，無疑是重要支撐。