李淑芬， 宋卓慧， 李 婷， 孫 婧， 范毅敏， 劉 燕△

(長治醫(yī)學院 1生理學教研室， 2機能綜合實驗室， 山西 長治 046000)

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是一種嚴重的臨床疾病，主要以炎癥和急性呼吸衰竭為特征[1]，由于其常伴有多器官衰竭以及較高的死亡率，因此該疾病備受關注[2]。炎癥反應的失調、白細胞和血小板的異常招募和激活以及肺上皮細胞通透性的改變等均是ARDS的核心病理事件，它們協同作用造成炎癥反應的爆發(fā)以及凋亡的發(fā)生，從而導致呼吸膜的形態(tài)和功能損傷[3-4]。盡管很多臨床試驗對一些藥理學干預手段進行了評估，但是至今仍沒有有效藥物能顯著減少該疾病的死亡率[5]。因此，對于該疾病的發(fā)病機理進行深入探討顯得尤為重要。

近來年，越來越多研究表明代謝酶除了發(fā)揮已知的代謝功能，還具有其它新的作用[6-8]。而其中，作為糖酵解途徑的第一個限速酶，己糖激酶(hexokinase，HK)的研究也日益引起人們的關注。在哺乳動物中，己糖激酶有4個家族成員[9]，其中HK1在各組織內廣泛表達，而HK2的表達主要是在一些胰島素敏感的組織和腫瘤中[10]。不同于其它糖酵解過程中的酶，HK主要定位于線粒體[11]。除了在糖酵解過程中的經典作用，HK2被證明還可以通過抗氧化、抑制線粒體依賴的凋亡事件以及促進自噬過程等多種途徑對細胞起保護作用[9]。在肺上皮細胞方面，Ahmad等[12]研究表明，過表達HK2通過保護線粒體而抑制缺氧/復氧造成的肺上皮樣細胞A549氧化應激損傷；Yao等[13]研究發(fā)現，Dicer通過調節(jié)miRNAs表達，進一步上調HK2表達，逆轉低氧誘導的肺泡上皮細胞凋亡。由此我們可以看到，HK將能量產生、細胞生存途徑、線粒體穩(wěn)態(tài)維持、免疫反應等多種反應有效整合起來，從而實現對細胞穩(wěn)態(tài)的調控。

脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)來源于革蘭氏陰性細菌，是造成感染性休克的主要原因之一[14]，同時也可造成肺損傷和肺泡細胞的凋亡[1, 15-16]。由于炎癥反應在ARDS的發(fā)生和發(fā)展中是一重要病理因素，因此在本研究中我們將LPS作用于人肺上皮細胞BEAS-2B，觀察LPS對細胞活力和凋亡的作用，以及HK2是否可以對該過程產生影響。我們期待本研究能為ARDS的分子機理提供新的解釋，并為ARDS治療提供潛在靶點。

材 料 和 方 法

1 實驗材料

人正常肺上皮細胞BEAS-2B購自于美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection， ATCC)。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS; Gibco，10099-141)；高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibco，11965-084)；胰蛋白酶(Thermo Fisher Scientific，25200056)；CCK-8染色液和抗細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)抗體(碧云天)；Annexin V/PI染色試劑盒(BioTools，B32117)；抗HK2抗體(Santa Cruz，sc-6521)；抗凋亡誘導因子(apoptosis-inducing factor,AIF)抗體(Abcam，ab220215)；抗Bax和Bcl-2抗體(Cell Signaling Technology，2772和4223)；抗α-tubulin抗體(Bioworld，AP0064)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng) BEAS-2B細胞生長于含有10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中。當細胞處于對數生長期時，使用含有EDTA的0.25% 胰蛋白酶將細胞消化，用培養(yǎng)基重懸后接種于不同器皿中進行后續(xù)實驗。

2.2CCK-8法檢測細胞活力 細胞按照每孔4 000個的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，給予相應處理結束后，每孔加入10 μL CCK-8染色液，在細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后，在450 nm處測定各孔吸光度(A)值。

2.3Hoechst 33342染色鑒定細胞凋亡 細胞接種于24孔板中，待細胞貼壁后給予各種處理。處理至相應時間后加入Hoechst 33342溶液，工作液終濃度為50 mg/L。染色30 min后去除上清，使用PBS緩沖液洗滌3次,每次5 min。洗滌結束后利用尼康熒光顯微鏡進行成像以觀察細胞核染色狀況。

2.4Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡 細胞進行各項處理結束后以胰蛋白酶消化利用PBS緩沖液重懸獲取單細胞懸液，調整細胞密度至1×109/L，根據說明書利用Annexin V/PI染色試劑避光染色30 min后，立即用流式細胞術檢測細胞凋亡狀況并進行分析。

2.5Western blot法檢測蛋白表達水平 細胞接種于35 mm培養(yǎng)皿中給予相應處理至相應時間。結束后，利用真空泵去除上清并以預冷PBS緩沖液洗滌細胞。徹底去除PBS，加入200 μL細胞裂解液。利用BCA法將各組樣品定量至相同濃度后，取20 μg蛋白進行SDS-PAGE，電泳結束后，濕轉法將蛋白質轉移至甲醇預活化的PVDF膜，轉膜條件為恒壓100 V，時間為2 h。之后利用5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h并孵育相應抗體， 4 ℃過夜；次日，以TBST洗滌后室溫孵育相應 II 抗，1 h后利用化學發(fā)光成像儀顯影。

2.6免疫熒光法檢測HK2亞細胞定位 BEAS-2B細胞接種于confocal專用8連孔中，處理結束后加入MitoTracker probes染色20 min進行線粒體定位。染色結束后利用PBS洗滌5 min后使用4%多聚甲醛在室溫下進行固定15 min，之后使用PBST洗滌3次,每次5 min。接下來使用0.1% Triton進行穿孔，同上再次洗滌。按照說明書推薦濃度加入相應抗體，4 ℃孵育過夜。次日孵育結束后，加入相應 II 抗在37 ℃孵育1 h,利用激光共聚焦顯微鏡進行成像。

2.7BEAS-2B細胞中轉染HK2過表達質粒 細胞接種于6孔板中，貼壁后利用Lipofectamine 3000轉染攜帶eGFP的HK2過表達質粒，24 h后更換為新鮮培養(yǎng)基。根據說明書具體操作如下，首先在250 μL Opti-MEM中加入Lipofectamine 3000 5 μL；其次在250 μL Opti-MEM中加入質粒1 μg和P3000 3 μL，混合均勻；將上述質粒DNA混合物加入Lipofectamine 3000混合物中，室溫下孵育5 min再加入細胞2.5 mL培養(yǎng)基中。

2.8提取線粒體以檢測線粒體和細胞漿的Cyt C以及AIF蛋白 將BEAS-2B細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中，給予LPS或者在HK2過表達后給予LPS處理，之后消化細胞室溫下100×g離心10 min以收集細胞。按照線粒體提取試劑盒說明書(碧云天，C3601)進行操作提取線粒體。保留線粒體和去除線粒體成分的細胞漿提取物進行Western blot實驗以檢測Cyt C和AIF蛋白的亞細胞分布。

3 統(tǒng)計學方法

實驗數據均采用均數±標準差(mean±SD)表示，并利用GraphPad Prism軟件進行后續(xù)統(tǒng)計學分析。對于兩組定量資料和多組定量資料的比較，數據在滿足正態(tài)分布和方差齊的條件下，分別采用雙側t檢驗和單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 LPS刺激導致肺上皮BEAS-2B細胞活力下降

用不用濃度(0、1、10和100 mg/L)的LPS處理BEAS-2B細胞，24 h后檢測細胞活力，結果顯示，LPS可以呈現劑量依賴性地使BEAS-2B細胞活力下降。當LPS濃度為10 mg/L和100 mg/L時，細胞活力分別為對照組的69.36%和41.37%，較對照組顯著降低(P<0.01)。另選取100 mg/L LPS分別作用于BEAS-2B細胞12、24和48 h，在經過不同處理時間后，細胞活力隨作用時間延長顯著下降(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. LPS decreased the viability of BEAS-2B cells in a dose- and time-dependent manner. Mean±SD.n=4.##P<0.01vs0 mg/L group;*P<0.05,**P<0.01vs0 h group.

圖1LPS劑量和時間依賴性地抑制BEAS-2B細胞活力

2 LPS誘導BEAS-2B細胞凋亡

BEAS-2B細胞給予LPS (100 mg/L)處理24 h后，細胞核出現明顯固縮和碎裂的形態(tài)(圖中箭頭所示)，見圖2A。使用Annexin V/PI雙染法對細胞凋亡狀況進行流式細胞術分析，在LPS處理后，Annexin V染色陽性的細胞由2.89%增加至42.4%(圖中右上象限和右下象限之和)(P<0.01)，見圖2、2C。這些結果提示LPS可以誘導BEAS-2B細胞凋亡。

Figure 2.LPS induced BEAS-2B cell apoptosis. A: Hoechst 33342 staining (nuclear pyknosis and nuclear lysis shown by the white arrows，×400); B: flow cytometry with Annexin V/PI double staining. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2LPS刺激誘導BEAS-2B細胞發(fā)生凋亡

3 LPS可通過線粒體依賴途徑誘導BEAS-2B細胞凋亡

為辨別LPS引起的BEAS-2B細胞凋亡是通過細胞外在凋亡途徑還是線粒體凋亡途徑，在LPS刺激之前，我們對BEAS-2B細胞分別給予20 μmol/L z-IETD-fmk(caspase 8特異性抑制劑)或z-LEHD-fmk(caspase-9特異性抑制劑)預孵育1 h。結果顯示，z-LEHD-fmk顯著抑制LPS誘導的BEAS-2B細胞活力下降(P<0.01)；而z-IETD-fmk對該過程卻沒有影響，見圖3A。鑒于caspase-9是介導線粒體凋亡的執(zhí)行分子，我們初步推斷LPS可通過線粒體依賴通路誘導BEAS-2B細胞凋亡。Western blot結果顯示,在給予100 mg/L LPS處理BEAS-2B細胞12、24和48 h后，線粒體凋亡通路關鍵分子AIF與促凋亡蛋白Bax的蛋白表達逐漸增加，而凋亡抑制蛋白Bcl-2的蛋白表達隨之下降(P<0.01)，提示LPS可通過線粒體依賴通路誘導BEAS-2B細胞的凋亡,見圖3B。

4 HK2的表達下調介導LPS誘導的BEAS-2B細胞凋亡過程

為鑒定HK2是否參與了LPS誘導的BEAS-2B細胞凋亡過程，首先對HK2的表達進行了分析，結果顯示，隨著LPS作用時間的延長，HK2的表達顯著減少(P<0.01)，見圖4A。在BEAS-2B細胞中轉染攜帶eGFP的HK2過表達質粒，48 h后檢測過表達效果。結果顯示，在HK2過表達之后，細胞相對活力由(43.68±8.52)%增加至(88.39±7.25)%(P<0.05),見圖4B、C。

5 HK2通過抑制線粒體依賴通路減少LPS引起的人肺上皮細胞凋亡

HK2過表達之后其線粒體定位(圖中紅色和綠色重疊為黃色的部分)相較于LPS單獨處理組明顯增加，見圖5A。在LPS處理后，BEAS-2B細胞線粒體提取物中Cyt C和AIF顯著減少，釋放至細胞漿中增加；而HK2過表達可使得該過程被逆轉(P<0.01)，見圖5B。

討 論

ARDS是一種死亡率極高的疾病，但目前有效干預策略十分有限，這使得我們迫切需要重新審視或者更加深入認識該疾病的發(fā)生發(fā)展過程。在ARDS的病理過程中，肺上皮細胞的異常凋亡增加是主要病理表現之一。因此，本研究我們以LPS刺激肺上皮細胞BEAS-2B細胞模擬其肺損傷。本研究發(fā)現，給予LPS刺激后，BEAS-2B存活率降低。有研究表明，細胞在凋亡過程中伴隨著細胞核固縮和Annexin V陽性細胞增加[17-18]。為研究LPS誘導的BEAS-2B存活率降低，是否與凋亡相關，本研究采用Hoechest 33342染核和Annexin V/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡，發(fā)現LPS引起了細胞核固縮和細胞凋亡，且本研究進一步確認了LPS可通過線粒體途徑誘導的BEAS-2B凋亡。

Figure 3.LPS induced mitochondria-dependent apoptosis in the BEAS-2B cells. A: z-LEHD-fmk, the specific inhibitor of caspase-9, reversed the pro-apoptotic effect of LPS, whereas caspase-8 inhibitor z-IETD-fmk did not; B: LPS enhanced the expression of AIF and Bax, and suppressed the expression of Bcl-2. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsLPS group;△△P<0.01vs0 h group.

圖3LPS誘導BEAS-2B細胞呈現線粒體依賴的凋亡

大量研究表明HK2定位于線粒體，通過維持線粒體結構的完整性從而抑制凋亡事件的發(fā)生[19-21]。為研究HK2是否參與LPS誘導的BEAS-2B細胞凋亡進程，本研究首先檢測了在LPS誘導的BEAS-2B細胞凋亡進程HK2的表達，發(fā)現隨著時間的進展HK2表達逐漸降低；而過表達HK2能逆轉LPS誘導的活性降低。因已有報道HK2定位于線粒體[19-21]，本研究針對線粒體途徑介導凋亡過程的觀察發(fā)現HK2的過表達可以有效逆轉該過程。當細胞發(fā)生線粒體依賴的凋亡時，位于線粒體間隙的細胞色素C和AIF等分子被釋放至細胞漿中，從而誘發(fā)下游效應分子發(fā)生效應。本研究發(fā)現，HK2過表達可阻斷AIF以及細胞色素C等分子從線粒體釋放至細胞漿的過程，因此推測過表達HK2可以使HK2重新分布于線粒體以維持其結構的完整性從而發(fā)揮了抗凋亡效應。越來越多的研究表明，己糖激酶是炎性小體激活過程中的重要調控子[22]，而失調的炎癥反應也是ARDS的重要病理過程，我們有理由相信HK2可通過多途徑在ARDS或者肺損傷中發(fā)揮保護作用。以往研究表明，在LPS誘導的肺損傷過程中，同時存在內質網依賴的凋亡，炎性小體介導的細胞凋亡等事件[17, 23-24]。因此，HK2是否可以通過其他途徑發(fā)揮其抵抗LPS誘導的BEAS-2B細胞凋亡也值得我們進一步探討。

Figure 4.HK2 was involved in LPS induced-apoptosis of BEAS-2B cells. A: LPS treatment caused the down-regulation of HK2 in a time-dependent manner; B: after transfection with HK2-ORF plasmid, the expression level of HK2 was determined by Wes-tern blot; C: the results of CCK-8 assay showed that HK2 over-expression reversed the decreased cell viability induced by LPS. Mean±SD.n=4.***P<0.01vs0 h group;##P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsLPS group.

圖4HK2參與LPS誘導的BEAS-2B細胞凋亡

本研究表明，HK2表達下調是LPS誘導BEAS-2B進行線粒體依賴性凋亡的必要條件，過表達HK2可使得HK2重新分布于線粒體從而發(fā)揮抗凋亡效應。本研究為ARDS的分子病理機制提供了新的解釋，并為其治療提供了潛在的可行靶點。

Figure 5.HK2 over-expression reversed mitochondria-dependent apoptosis of the BEAS-2B cells induced by LPS. A: the distribution of HK2 in mitochondria (the yellow part) was involved in its anti-apoptotic effect (×1 000); B: LPS treatment induced the release of Cyt C and AIF from mitochondrion to cytoplasm, which was reversed by HK2 over-expression. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsLPS group.

圖5HK2過表達通過抑制線粒體依賴通路逆轉LPS引起的BEAS-2B細胞凋亡