蔣娟莉， 劉愛東， 楊 杰

(成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科， 四川 成都 610500)

動脈粥樣硬化(artherosclerosis，AS)是一種涉及多基因遺傳、免疫和血管管壁細(xì)胞等多階段、多發(fā)性共同長期發(fā)展的復(fù)雜疾病，冠狀A(yù)S繼續(xù)發(fā)展可造成管腔狹窄和血流量減少，從而使心肌發(fā)生缺血死亡，最終引起進(jìn)行心肌梗死、猝死、心絞痛和心律失常等疾病[1]。目前在細(xì)胞水平上對AS的研究還缺乏確定的細(xì)胞系，已得到深度認(rèn)可的細(xì)胞水平的研究報道較為少見，多采用細(xì)胞模型構(gòu)建方法研究在細(xì)胞水平上對AS的影響[2]。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)常被用來觀察和驗(yàn)證在AS過程中血管內(nèi)皮細(xì)胞的一系列病理變化[3]。鈣調(diào)節(jié)熱穩(wěn)定蛋白 1 (calcium-regulated heat stable protein 1，CARHSP1)是一種胞質(zhì)蛋白，主要存在于外分泌體及P小體中，已被證實(shí)是一種蛋白質(zhì)鈣調(diào)磷酸酶的生物底物，近年來的研究顯示CARHSP1是使腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的mRNA保持穩(wěn)定的一種強(qiáng)化劑，而TNF-α可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[4]。有研究顯示，抑制CARHSP1的表達(dá)可降低動脈粥樣硬化泡沫細(xì)胞中TNF-α的釋放，而激活CARHSP1的表達(dá)反之[5]。目前CARHSP1對動脈粥樣硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞活力和凋亡的影響及機(jī)制研究還未清楚。因此，本研究通過將CARHSP1-siRNA或CARHSP1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，檢測細(xì)胞活力及凋亡的變化，并研究其可能的分子機(jī)制，為動脈粥樣硬化的分子靶向治療提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 一般資料

收集成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2015年3月～2016年8月經(jīng)血管造影確診為動脈粥樣硬化患者，共50例，其中男性患者24例，女性患者26例，年齡為50～79歲，平均年齡為(67.4±10.1)歲。所有患者排除曾患有心絞痛、心肌梗死及糖尿病病史。造影診斷指標(biāo)參照中華醫(yī)學(xué)會發(fā)布的《非ST段抬高急性冠狀動脈綜合征診斷和治療指南》及中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會發(fā)布的《WS319冠狀動脈粥樣硬化性心臟病診斷標(biāo)準(zhǔn)2010》進(jìn)行診斷，在進(jìn)行手術(shù)時切除后期患者的斑塊組織。另選擇50例性別和年齡等相匹配的體檢正常志愿者血管組織作為對照組，其中男25例，女25例，年齡47～78歲，平均年齡(66.7±9.1)歲，均符合入選標(biāo)準(zhǔn)。組織標(biāo)本采集后即可放入液氮罐中保存。本研究通過成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)，與所有的研究對象簽訂知情同意書。

2 主要試劑和儀器

ECM培養(yǎng)基和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購自Gibco；CCK-8細(xì)胞活力試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自BD；抗CARHSP1、caspase-3、cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax抗體均購自Abcam。酶標(biāo)儀購自BioTek；流式細(xì)胞儀購自BD。

3 方法

3.1Western blot檢測動脈粥樣硬化斑塊中CARHSP1的蛋白表達(dá) 從液氮罐中取出動脈粥樣硬化斑塊及正常組織，加入適量的裂解液充分裂解，離心后收集蛋白，考馬斯亮藍(lán)法對蛋白濃度進(jìn)行測定。取等量蛋白行SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，PVDF膜置于封閉液(5%的脫脂奶粉)中封閉1～2 h，加入 I 抗(CARHSP1及內(nèi)參照GAPDH抗體均按照說明書稀釋)，4 ℃搖擺過夜，洗膜，孵育 II 抗和顯影液，置于室溫環(huán)境中避光30 min，洗膜，以GAPDH為內(nèi)參照，暗室中ECL顯影。蛋白表達(dá)水平以目的條帶灰度值與GAPDH的灰度值比值表示。

3.2細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購自ATCC，細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中用ECM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后更換成新的培養(yǎng)液以去除未貼壁的細(xì)胞，此后每2 d換液 1 次，直至細(xì)胞達(dá)到生長融合。選擇生長至對數(shù)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

3.3CARHSP1-siRNA和CARHSP1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVECs HUVECs在轉(zhuǎn)染前接種于6孔板，細(xì)胞達(dá)80%生長融合時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染CARHSP1-siRNA和pcDNA3.1-CARHSP1，并分別設(shè)置siRNA陰性對照 (negative control siRNA, NC-siRNA)組和空載體組(pcDNA 3.1組)，只加入培養(yǎng)基的為空白對照(blank)組。轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明。收集轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，參照方法3.1檢測各組細(xì)胞中CARHSP1的蛋白表達(dá)。

3.4CCK-8法檢測細(xì)胞活力 內(nèi)皮細(xì)胞缺氧培養(yǎng)模型的建立采用AnaeroPack-Anaero厭氧培養(yǎng)產(chǎn)氣袋。將HUVECs分為正常培養(yǎng)(normal culture)組、缺氧(hypoxia)組、缺氧+CARHSP1-siRNA(hypoxia+CARHSP1-siRNA)組和缺氧+pcDNA3.1-CARHSP1(hypoxia+pcDNA3.1-CARHSP1)組。HUVECs進(jìn)行缺氧培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃孵育4 h。酶標(biāo)儀測定570 nm吸光度(A)值，以A值反映細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.5流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率 各組細(xì)胞凋亡率的檢測采用Annexin V-FITC/PI雙染法，具體操作參照Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡試劑盒操作說明。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.6RT-PCR檢測白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)和C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)的mRNA表達(dá) 總RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，20 μL反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃ 15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)。每孔設(shè)置3個復(fù)孔。 IL-6的上游引物序列為5’-CTTCGGTCCAGTTGCCTTCT-3’， 下游引物序列為5’-GTGAGTGGCTGTCTGTGTG-3’；CRP的上游引物序列為5’-GGTCTTGACCAGCCTCTCTC-3’， 下游引物序列為5’-CTTCGTTAACGGTGCTTTGA-3’；內(nèi)參照GAPDH 的上游引物序列為5’-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3’， 下游引物序列為5’-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3.7Western blot檢測CARHSP1和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá) 將HUVECs按方法3.4分組并進(jìn)行相應(yīng)處理，采用Western blot法檢測各組細(xì)胞中caspase-3、cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白表達(dá)，方法同3.1。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CARHSP1蛋白在動脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)

從動脈粥樣硬化斑塊提取蛋白，Western blot檢測斑塊中 CARHSP1的蛋白表達(dá)量，結(jié)果顯示，CARHSP1在動脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)顯著高于對照組(P<0.05)，見圖1。

2 CARHSP1 siRNA和CARHSP1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVECs的效果

與空白組比較，NC-siRNA組和pcDNA3.1組的CARHSP1蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；CARHSP1-siRNA組的CARHSP1蛋白表達(dá)顯著低于空白組(P<0.05)，CARHSP1-pcDNA3.1組的CARHSP1蛋白表達(dá)顯著高于空白組(P<0.05)，見圖2。

Figure 1.The protein expression of CARHSP1 in the atherosclerotic plaques. Mean±SD.n=50.*P<0.05vscontrol group.

圖1CARHSP1蛋白在動脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)

Figure 2.The effects of CARHSP1-siRNA and CARHSP1 over-expression plasmid on the protein expression of CARHSP1 in the HUVECs. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsblank group.

圖2CARHSP1-siRNA和CARHSP1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVECs的效果觀察

3 CARHSP1基因?qū)θ毖跽T導(dǎo)的HUVECs活力和凋亡的影響

缺氧組HUVECs活力顯著低于正常培養(yǎng)組(P<0.05)，凋亡率顯著高于正常培養(yǎng)組(P<0.05)；與缺氧組比較，缺氧+CARHSP1-siRNA組細(xì)胞活力顯著升高(P<0.05)，凋亡率顯著降低(P<0.05)，缺氧+pcDNA3.1-CARHSP1組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The effects ofCARHSP1 gene on the viability (A) and apoptosis (B) of HUVECs induced by hypoxia. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal culture group;#P<0.05vshypoxia group.

圖3CARHSP1基因?qū)θ毖跽T導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞活力和凋亡的影響

4 CARHSP1基因?qū)θ毖跽T導(dǎo)的HUVECs中IL-6和CRP mRNA表達(dá)的影響

缺氧組細(xì)胞的IL-6和CRP表達(dá)顯著高于正常培養(yǎng)組(P<0.05)；與缺氧組比較，缺氧+CARHSP1-siRNA組細(xì)胞的IL-6和CRP表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，缺氧+pcDNA3.1-CARHSP1組細(xì)胞的IL-6和CRP表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The effects ofCARHSP1 gene expression on IL-6 and CRP mRNA expression in HUVECs induced by hypoxia. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal culture group;#P<0.05vshypoxia group.

圖4CARHSP1基因?qū)θ毖跽T導(dǎo)的HUVECsIL-6和CRPmRNA表達(dá)的影響

5 CARHSP1基因?qū)θ毖跽T導(dǎo)的HUVECs中CARHSP1、caspase-3、cleaved caspase-3、 Bcl-2和Bax蛋白水平的影響

缺氧可明顯誘導(dǎo)CARHSP1表達(dá)升高(P<0.05);正常培養(yǎng)組、缺氧組、缺氧+CARHSP1-siRNA組和缺氧+pcDNA3.1-CARHSP1組間caspase-3蛋白水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。缺氧組的cleaved caspase-3及Bax蛋白表達(dá)顯著高于正常培養(yǎng)組(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著低于正常培養(yǎng)組(P<0.05)；缺氧+CARHSP1-siRNA組的cleaved caspase-3及Bax蛋白水平顯著低于缺氧組(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著高于缺氧組(P<0.05)；缺氧+pcDNA3.1-CARHSP1組的cleaved caspase-3及Bax的蛋白水平顯著高于缺氧組(P<0.05)，Bcl-2的蛋白表達(dá)顯著低于缺氧組(P<0.05)，見圖5。

Figure 5. The effects ofCARHSP1 gene expression on the protein levels of CARHSP1, caspase-3, cleaved caspase-3, Bcl-2 and Bax in the HUVECs induced by hypoxia. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal culture group;#P<0.05vshypoxia group.

圖5CARHSP1基因表達(dá)對缺氧誘導(dǎo)的HUVECs中CARHSP1、caspase-3、cleavedcaspase-3、Bcl-2和Bax蛋白水平的影響

討 論

研究發(fā)現(xiàn)，缺氧可促發(fā)動脈粥樣硬化，血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能障礙及損傷是脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵因素[6-7]，缺氧可加速血管內(nèi)皮細(xì)胞自由基的產(chǎn)生，而自由基的產(chǎn)生可引起細(xì)胞的損傷[8]，因此本研究通過缺氧誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞，以此研究CARHSP1對動腦粥樣硬化的影響。本研究發(fā)現(xiàn)CARHSP1在AS斑塊中的表達(dá)高于正常者，通過在體外建立HUVECs的缺氧模型，并將CARHSP1-siRNA和CARHSP1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVECs，發(fā)現(xiàn)缺氧可抑制HUVECs的活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而抑制CARHSP1表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡，過表達(dá)則反之。CARHSP1對AS的影響目前還未明確。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可通過靶向抑制CARHSP1表達(dá)影響TNF-α的穩(wěn)定性，使炎癥反應(yīng)減輕，從而對AS起到保護(hù)作用[9]。本研究從CARHSP1對HUVECs細(xì)胞活力及凋亡的影響方面說明其對AS的保護(hù)作用。

在AS過程中有多個炎癥分子參與其中，如IL-6、TNF-α和CRP等[10]。在炎癥反應(yīng)過程中IL-6起到核心調(diào)節(jié)作用，是引起炎癥反應(yīng)的一個重要介質(zhì)，在血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞等多種人體細(xì)胞都能產(chǎn)生IL-6[11]。研究發(fā)現(xiàn)，在AS形成過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷后可引起TNF-α的釋放，TNF-α又可增加IL-6的釋放。目前，IL-6已被認(rèn)為是心血管事件預(yù)測的一個獨(dú)立危險因子[12]。CRP可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，是組織炎癥及感染一個非特異性但有敏感性的標(biāo)志物，其在健康人表達(dá)升高與心血管事件危險性有密切的聯(lián)系[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧組IL-6和CRP的表達(dá)均顯著升高，而抑制CARHSP1表達(dá)可降低IL-6和CRP表達(dá)，過表達(dá)CARHSP1則反之。這提示CARHSP1在AS中可通過負(fù)向調(diào)節(jié)IL-6和CRP而降低炎癥反應(yīng)，從而對血管起保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡受到多種基因如caspase家族和Bcl-2家族的調(diào)控。Caspase-3是caspase家族中的一員，研究發(fā)現(xiàn)，在AS不穩(wěn)定斑塊中剪切后的caspase-3的表達(dá)升高，血管內(nèi)皮細(xì)胞中剪切后的caspase-3的活化可誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡[15-17]。Bcl-2家族有促凋亡和抗凋亡蛋白，Bcl-2為抗凋亡蛋白，Bax為促凋亡蛋白，Bcl-2表達(dá)降低，Bax表達(dá)升高，可引起細(xì)胞發(fā)生凋亡，多種研究中均用Bcl-2和Bax比例衡量細(xì)胞的凋亡情況[18-20]。研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中可通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax表達(dá)促進(jìn)或抑制細(xì)胞的凋亡[21-22]。本研究結(jié)果顯示，缺氧可上調(diào)cleaved caspase-3及Bax的水平，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，抑制CARHSP1表達(dá)可降低cleaved caspase-3及Bax的水平，促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，過表達(dá)CARHSP1則反之。這提示CARHSP1對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡可通過調(diào)節(jié)caspase家族和Bcl-2家族相關(guān)蛋白發(fā)揮作用。

綜上所述，本研究證實(shí)在AS斑塊中CARHSP1表達(dá)升高，抑制CARHSP1表達(dá)可提高HUVECs的細(xì)胞活力，降低細(xì)胞凋亡，下調(diào)免疫因子IL-6和CRP表達(dá)；而過表達(dá)CARHSP1則反之。本研究提示CARHSP1可能作為AS分子診斷及靶向治療標(biāo)志，但本研究所涉及的內(nèi)容有限，還需更多研究支持。