李明航， 田曉翠， 安瑞娣， 張 倩， 楊 梅， 向 菲， 王鈺淳， 徐 露， 董 志

(重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 重慶市生物化學(xué)與分子藥理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 重慶 400016)

腦血管疾病是目前嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，其中缺血性腦血管疾病所占比重更大[1]，該類疾病的發(fā)病原因主要是腦組織供血中斷，短時(shí)間內(nèi)不能恢復(fù)血供，其治療的基本策略是及時(shí)恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)。但是若超過治療時(shí)間窗，重新恢復(fù)腦組織的血液供應(yīng)會(huì)進(jìn)一步加重大腦功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷，即腦缺血再灌注(cerebral ischemia-reperfusion，CIR)損傷[2]。在缺血再灌注早期，血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的不可逆破壞會(huì)導(dǎo)致血管源性腦水腫，從而引發(fā)繼發(fā)性腦損傷。血腦屏障是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和血液之間的一道物理屏障，其主要功能是監(jiān)管出入物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受各種內(nèi)外因素的傷害；因此，BBB在維持大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)中起著重要的作用[3]。基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein-9，MMP-9)是與血腦屏障密切相關(guān)的一種基質(zhì)金屬蛋白酶，它通過降解血腦屏障基底膜以及內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密連接，參與組織重塑以及血腦屏障的破壞，當(dāng)血腦屏障損傷時(shí)可以觀察到大量的MMP-9 表達(dá)[4-6]，已有研究發(fā)現(xiàn)絲裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路是參與血腦屏障保護(hù)作用的一條關(guān)鍵通路[7]。全反式維甲酸(all-transretinoic acid，ATRA)是動(dòng)物體內(nèi)維生素A的代謝中間產(chǎn)物，有著廣泛的生理學(xué)和藥理學(xué)活性，有研究發(fā)現(xiàn)其有強(qiáng)大的抗氧化和抗炎作用[8]。本實(shí)驗(yàn)擬建立SD大鼠CIR損傷模型并給予ATRA干預(yù)，觀察ATRA對CIR損傷后大鼠的神經(jīng)功能、血腦屏障通透性及JNK/P38 MAPK信號通路的影響，探討其可能的保護(hù)作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

清潔級雄性SD大鼠65只，體重250～280 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號為SCXK(渝)2012-0001。

2 主要試劑

ATRA、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC)和伊文思藍(lán)染液(Sigma)；明膠酶譜檢測試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)；抗claudin-5抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；抗occludin、ZO-1和MMP-9抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；抗JNK、p-JNK、P38和p-P38抗體(CST)；Western blot相關(guān)試劑(上海碧云天生物有限公司)。

3 主要方法

3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和處理 將SD雄性大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)(sham)組、模型(CIR)組及ATRA(10、30和90 mg/kg)組。參照參考文獻(xiàn)[9]用線栓法建立大鼠中動(dòng)脈栓塞模型，缺血1.5 h后,緩慢拔出線栓，消毒，縫合傷口。Sham組除不插入線栓外與模型組行相同操作，ATRA組大鼠術(shù)后立即腹腔注射ATRA(10、30和90 mg/kg)，sham組和模型組注射等體積的溶劑。

3.2神經(jīng)行為學(xué)評分 再灌注24 h后，采用Longa等[10]的評分標(biāo)準(zhǔn)對不同處理組的大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。Longa評分標(biāo)準(zhǔn)分5個(gè)等級：0分：正常，無神經(jīng)功能缺損；1分：左側(cè)前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能缺損；2分：行走時(shí)，大鼠向左側(cè)(癱瘓側(cè))轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分：行走時(shí)，大鼠身體向左側(cè)(癱瘓側(cè))傾倒，重度神經(jīng)功能缺損；4分：不能自發(fā)行走，有意識(shí)喪失。

3.3腦梗死體積測定 各組大鼠于再灌注24 h后深度麻醉并斷頭取腦，置-20 ℃冰箱15 min，以視交叉為起點(diǎn)冠狀切為連續(xù)5片(1 mm)，然后置于2% TTC 染色液中37 ℃避光孵育30 min。染色后正常腦組織呈紅色，而梗死區(qū)域呈白色。將腦切片放入4%多聚甲醛中固定24 h，用濾紙去除腦片多余的多聚甲醛試液，置于藍(lán)色背景下，數(shù)碼相機(jī)拍照，采用Image-Pro Plus 5.0軟件測定腦梗死體積。

3.4腦組織含水量測定 各組大鼠分別于再灌注24 h后深度麻醉處死，并快速斷頭取腦，分離大腦半球，立即測其濕重，測完濕重后置于100 ℃ 的電烤箱約 24 h，然后迅速測其干重，記錄所測數(shù)據(jù)，按照以下公式計(jì)算了大鼠的腦水含量：腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

3.5血腦屏障通透性的評估 再灌注24 h后，從大鼠尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)溶液2 mL/kg，其黏膜和四肢等表淺部瞬間變藍(lán)。待伊文思藍(lán)在大鼠體內(nèi)循環(huán) 60 min后，用生理鹽水500 mL+4%多聚甲醛 500 mL 灌注并固定(甲酰胺提取法檢測的大鼠則不用固定)，固定完成后迅速斷頭取腦，置于冰上，進(jìn)行以下的實(shí)驗(yàn)步驟：(1) 腦表面攝影：將固定后的大鼠全腦沿冠狀面視交叉前的區(qū)域連續(xù)切片，每片厚度2 mm，總共5片，將腦片在白色背景上擺放整齊后照相; (2) 甲酰胺提取法：大鼠深度麻醉后用生理鹽水滴注，不固定。之后斷頭取出大鼠腦組織用生理鹽水沖洗，濾紙吸去殘余水分，待稱量完大鼠缺血側(cè)大腦半球濕重后，將其放入3 mL 二甲基甲酰胺溶液中，水浴箱60 ℃恒溫孵育24 h，10 000 r/min離心 30 min，取 200 μL上清液加入96孔酶標(biāo)板中，于630 nm 處測定吸光度(A)值。對倍稀釋法制作伊文思藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線，依據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出伊文思藍(lán)的含量，結(jié)果以μg/g 腦組織來表示。

3.6明膠酶譜法檢測MMP-9的活性 再灌注24 h后，提取待測腦組織的總蛋白，提取的總蛋白不煮沸，不變性，按照MMP-9明膠酶譜法檢測試劑盒說明書檢測MMP-9的活性。凝膠中由于含底物蛋白而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色而形成透亮區(qū)域，從而能同時(shí)指示MMP-9的大小位置(酶譜)及活性。

3.7Western blot 檢測組織中MMP-9、JNK/P38通路蛋白和緊密連接蛋白的水平 大鼠再灌注24 h 后，深度麻醉后迅速斷頭取腦，用液氮速凍，按照說明書提取大鼠缺血側(cè)半腦的總蛋白并測定其含量，各組蛋白經(jīng)12% SDS-PAGE 進(jìn)行分離，切膠，濕法轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂牛奶封閉2 h 后加入I抗[MMP-9(1∶1 000)、JNK(1∶1 000)、p-JNK(1∶500)、P38(1∶1 000)、p-P38(1∶500)、claudin-5(1∶200)、occludin(1∶1 000)和ZO-1(1∶1 000)]于4 ℃孵育過夜。用TBST洗膜3次，每次5 min,采用3步法，生物素標(biāo)記 II 抗(1∶2 000)結(jié)合，再結(jié)合辣根過氧化物酶標(biāo)記的streptavidin(1∶3 000)。洗膜后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影。應(yīng)用Image Lab 圖像分析軟件分析條帶A值，計(jì)算蛋白的相對表達(dá)量，以目的條帶與內(nèi)參照β-actin吸光度的比值作為蛋白相對表達(dá)量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，各組間差異的兩兩比較采用Tukey’st檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ATRA對CIR誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)功能缺損的影響

再灌注24 h后，與sham組相比，CIR組的神經(jīng)行為學(xué)評分升高，出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的神經(jīng)行為功能缺失;與CIR組相比，ATRA(10和30 mg/kg)可以降低大鼠神經(jīng)行為學(xué)評分,表明ATRA能減輕CIR誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)功能缺損，其中30 mg/kg 的ATRA效果最佳，見圖1。

Figure 1.The effect of ATRA on CIR-induced neurological function defect in the rats. Mean±SD.n=11.**P<0.01vssham group;#P<0.05vsCIR group.

圖1ATRA對CIR誘導(dǎo)的大鼠神經(jīng)功能缺損的影響

2 ATRA對CIR損傷后大鼠腦梗死體積的影響

與sham組相比，再灌注24 h后，CIR組缺血側(cè)腦半球出現(xiàn)了大面積白色梗死區(qū)域,腦梗死體積顯著升高；與CIR組相比，ATRA(10和30 mg/kg)干預(yù)可以縮小梗死范圍(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The effect of ATRA on the volume of cerebral infarction in CIR rats. Mean±SD.n=11.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsCIR group.

圖2ATRA對CIR損傷后大鼠腦梗死體積的影響

3 ATRA對CIR后大鼠腦含水量和血腦屏障通透性的影響

CIR組大鼠腦含水量和伊文思藍(lán)含量明顯高于sham組;與CIR組相比，ATRA(10和30 mg/kg)干預(yù)可以降低腦含水量和伊文思藍(lán)含量(P<0.01)，見圖3。

Figure 3.The effect of ATRA on brain water content (A) and blood-brain barrier permeability (B) after CIR in the rats. Mean±SD.n=11.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsCIR group.

圖3ATRA對CIR后大鼠腦含水量和血腦屏障通透性的影響

4 ATRA對CIR后大鼠腦組織MMP-9活性和蛋白表達(dá)的影響

與sham組相比，CIR組缺血側(cè)腦組織MMP-9的蛋白表達(dá)量及活性均增加;與CIR組相比，ATRA(10、30和90 mg/kg)能降低MMP-9蛋白的表達(dá)量及活性(P<0.01)，見圖4。

5 ATRA對CIR損傷后大鼠腦組織緊密連接蛋白表達(dá)的影響

再灌注24 h后，CIR組大鼠大腦組織緊密連接蛋白claudin-5、occludin和ZO-1的表達(dá)水平明顯低于sham組;與CIR組相比，ATRA組(30 mg/kg)干預(yù)能減少緊密連接蛋白的降解(P<0.01)，見圖5。

6 ATRA對大鼠CIR后JNK、P38及其p-JNK、p-P38蛋白水平的影響

CIR組的JNK/p38 MAPK通路明顯激活，JNK和P38磷酸化水平明顯升高;與CIR組相比，ATRA(10和30 mg/kg)明顯減少p-JNK和p-P38的含量，抑制JNK和P38的激活(P<0.01)，見圖6。

討 論

缺血性腦血管疾病是嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見疾病之一，致殘率及死亡率極高，腦缺血再灌注損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，有研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦損傷時(shí)，血腦屏障遭受了嚴(yán)重的破壞，血管的通透性增加，血液中多種成分外滲，從而加重了腦組織損傷[11]。血腦屏障的功能障礙在缺血性腦血管疾病中起著關(guān)鍵的作用[12-13]。保護(hù)血腦屏障的完整性被認(rèn)為是一種治療缺血性腦卒中的新療法[14]。

Figure 4.The effect of ATRA on the protein expression (A) and activity (B) of MMP-9 in rat brain tissues after CIR. Mean±SD.n=11.##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsCIR group.

圖4ATRA對CIR后大鼠腦組織MMP-9活性和蛋白表達(dá)的影響

Figure 5.The effect of ATRA on the protein expression of tight junction proteins in rat brain tissues after CIR injury. Mean±SD.n=11.##P<0.01vssham group;*P<0.05,**P<0.01vsCIR group.

圖5ATRA對CIR損傷后大鼠腦組織緊密連接蛋白表達(dá)的影響

Figure 6.The effect of ATRA on the protein levels of JNK, P38, p-JNK and p-P38 after CIR in rats. Mean±SD.n=10.##P<0.01vssham group;**P<0.01vsCIR group.

圖6ATRA對大鼠CIR后JNK、P38、p-JNK和p-P38蛋白水平的影響

基質(zhì)金屬蛋白酶是一類主要參與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)降解的蛋白酶超家族，其中MMP-9與腦缺血再灌注后血腦屏障的破壞關(guān)系最為密切[7]。正常的腦組織中，MMP-9的含量僅有低水平的表達(dá)，在急性腦缺血發(fā)生時(shí), MMP-9 在腦組織中表達(dá)明顯增高，降解內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接蛋白、IV 型膠原、V 型膠原等血管基底膜成分，導(dǎo)致血管通透性增加，破壞血腦屏障, 參與腦缺血病理過程[5]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn), 腦缺血再灌注24 h后，MMP-9的蛋白表達(dá)及活性均增加，緊密連接蛋白表達(dá)量降低，伊文思藍(lán)和腦含水量均增加; ATRA干預(yù)組的腦組織MMP-9 表達(dá)明顯減少,緊密連接蛋白降解程度減小，伊文思藍(lán)和腦含水量均降低,其中30 mg/kg ATRA的效果最佳，提示ATRA血腦屏障保護(hù)作用可能與降低MMP-9 活性有關(guān)。

有研究表明,MAPK級聯(lián)途徑是參與血腦屏障損傷作用的一條關(guān)鍵通路[15-16]。JNK和P38是MAPK通路的關(guān)鍵蛋白，近年來國外的研究也證實(shí)JNK/P38 MAPK 通路幾乎全都涉及了缺血性腦損傷所有的生理病理過程，是參與血腦屏障損傷的一條最為關(guān)鍵的通路[15]。研究發(fā)現(xiàn)，在多種刺激條件下，p38 MAPK 通路參與介導(dǎo)了誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的生成[17]。腦缺血再灌注后產(chǎn)生大量的一氧化氮(nitric oxide，NO)，其中 NO通過鳥苷酸環(huán)化酶對MMP-9進(jìn)行調(diào)節(jié)[18]，進(jìn)而促進(jìn)了缺血性腦損害的發(fā)展。全反式維甲酸是維生素A的一種活性代謝產(chǎn)物，介導(dǎo)維生素A的絕大部分生物學(xué)功能。以前的研究發(fā)現(xiàn)，維甲酸在血腦屏障的形成中起重要作用[19]。而我們的研究結(jié)果提供了一些有關(guān)全反式維甲酸對缺血再灌注破壞的血腦屏障的保護(hù)作用的新見解。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，再灌注24 h后，模型組大鼠腦組織中的p-JNK和p-P38蛋白表達(dá)增加，ATRA干預(yù)可以明顯抑制p-JNK和p-P38蛋白表達(dá)，30 mg/kg的效果最佳，并且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)腦缺血后JNK和P38的總蛋白表達(dá)總量基本沒有變化。以上結(jié)果提示，全反式維甲酸可能通過抑制JNK和P38的活化來減輕大鼠腦缺血再灌注引起的血腦屏障損傷。

但是，關(guān)于全反式維甲酸對血腦屏障的保護(hù)作用機(jī)制依然有很多問題需要進(jìn)一步探討。例如，本實(shí)驗(yàn)主要研究全反式維甲酸在腦缺血再灌注損傷的預(yù)后作用，全反式維甲酸的預(yù)防作用還需進(jìn)一步研究明確。更重要是，全反式維甲酸高劑量(90 mg/kg)沒有達(dá)到預(yù)期的保護(hù)作用，因此需要進(jìn)一步論證全反式維甲酸的給藥時(shí)間和給藥劑量。