華宏軍， 龔道軍， 葉曉華， 陳 媛， 陳燕萍， 韋 祎

(金華市中心醫(yī)院， 浙江 金華 321000)

胰腺癌是一種惡性程度很高、預(yù)后最差的惡性腫瘤，被稱為“癌中之王”。由于胰腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力極高，且目前仍缺少胰腺癌的早期確診手段，因此多數(shù)患者確診時已是胰腺癌晚期，手術(shù)成功率很低，5年生存率遠低于10%[1-2]。對于胰腺癌患者而言，系統(tǒng)性化療是不可或缺的治療方案[3]。然而很多胰腺癌患者體內(nèi)的腫瘤細胞對化療藥物并不敏感，采取輔助治療措施提高腫瘤細胞的化療敏感性是改善抗腫瘤治療的重要課題。

吉西他濱(gemcitabine,GEM)屬于嘧啶類抗腫瘤藥物，其主要代謝物能摻入腫瘤細胞的DNA，從而破壞DNA的功能，激活腫瘤細胞的凋亡途徑[4-5]。目前吉西他濱已作為一線化療藥物用于原位及轉(zhuǎn)移性胰腺癌的治療，然而在化療過程中經(jīng)常出現(xiàn)腫瘤細胞對吉西他濱的抵抗性[6-7]，因此聯(lián)合輔助治療藥物改善吉西他濱的抗腫瘤活性具有十分重要的臨床意義。

青蒿琥酯(artesunate)是提取自菊科植物黃花蒿葉的天然活性成分，臨床主要用于瘧疾的治療。然而近期的研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯除抗瘧作用外，還具有一定的抗腫瘤活性[8-9]。本研究的目的在于探討青蒿琥酯在體外對吉西他濱抗胰腺癌活性的增效作用并研究其機制。

材 料 和 方 法

1 細胞培養(yǎng)

人胰腺癌細胞系Capan-2購于美國模式培養(yǎng)物保存中心(American Type Culture Collection，ATCC)，培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5% CO2。細胞每2～3 d傳代1次，傳代時，用胰酶消化液使細胞進入懸浮狀態(tài)并用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，將細胞懸液按1∶3稀釋后傳代。

2 實驗試劑

吉西他濱、噻唑藍[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]、青蒿琥酯、二甲亞砜和Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購于Sigma-Aldrich；DMEM培養(yǎng)基購于Gibco；抗鼠雙微體蛋白2(murine double minute protein 2，MDM2)、p53、Puma、Noxa、caspase-9、caspase-3、細胞色素C(cytochrome C)、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor)和GAPDH抗體購于Cell Signaling Technology；JC-1線粒體膜電位染料和線粒體分離試劑盒購于碧云天生物科技有限公司；MDM2小干擾RNA(small interfering RNA,MDM2 siRNA)購于Santa Cruz；ECL顯色試劑盒購于Pierce;Lipofectamine 2000購于Invitrogen。

3 方法

3.1MDM2過表達與基因沉默 人MDM2基因的開放閱讀框架全長序列經(jīng)PCR擴增后以分子克隆的方法與質(zhì)粒pcDNA3.1連接后構(gòu)建成MDM2重組質(zhì)粒，用于MDM2的過表達。MDM2 siRNA用于MDM2的基因沉默。質(zhì)粒及siRNA用Lipofectamine 2000按試劑操作說明書步驟進行轉(zhuǎn)染，簡要步驟如下：將2 mg/L質(zhì)?；?0 nmol/L siRNA用脂質(zhì)體2000進行包裹后將其加入到無血清培養(yǎng)基進行混合。將貼壁的Capan-2細胞置于該無血清培養(yǎng)基孵育6 h后棄去無血清培養(yǎng)基并加入新鮮的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。

3.2MTT法測定細胞活力 將轉(zhuǎn)染后的Capan-2細胞按每孔5×109接種在96孔板上孵育過夜，之后加入吉西他濱(0～32 μmol/L)和青蒿琥酯(0～160 μmol/L)處理48 h。孵育后在各培養(yǎng)孔中加入20 μL 5 g/L MTT再培養(yǎng)4 h，小心吸去上清液，往孔中加入150 μL 二甲亞砜，充分振蕩后在570 nm波長下用酶標儀檢測吸光度(A)值。細胞活力結(jié)果用各處理組與對照組的A值比值表示。繪制細胞活力-吉西他濱濃度曲線，根據(jù)曲線計算吉西他濱對Capan-2細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

3.3流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 Capan-2細胞經(jīng)吉西他濱(1 μmol/L)和青蒿琥酯(10 μmol/L)處理48 h后收集細胞，用生理鹽水洗滌2次，按照凋亡檢測試劑盒說明書步驟用Annexin V和碘化丙啶(PI)對細胞進行染色孵育20 min。之后采用流式細胞術(shù)檢測Capan-2細胞的凋亡，凋亡率用Annexin V陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比表示。

3.4細胞線粒體膜電位的檢測 Capan-2細胞經(jīng)吉西他濱(1 μmol/L)和青蒿琥酯(10 μmol/L)處理48 h后收集細胞，用生理鹽水洗滌2次，加入終濃度為2 mg/L的JC-1染料孵育Capan-2細胞。20 min后，再用生理鹽水將Capan-2細胞洗滌3次，之后采用流式細胞術(shù)檢測JC-1發(fā)出的紅色熒光，紅色熒光強度越強，則表示線粒體膜電位越高[10]。

3.5線粒體分離 轉(zhuǎn)染后的Capan-2細胞經(jīng)吉西他濱(1 μmol/L)和青蒿琥酯(10 μmol/L)處理48 h后收集細胞，用生理鹽水洗滌2次，再使用線粒體分離試劑盒按說明書所示步驟分離移除Capan-2細胞中的線粒體，收集無線粒體的細胞質(zhì)用以檢測其中的細胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子。無線粒體的細胞質(zhì)中細胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子蛋白水平越高，則說明線粒體細胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放水平越高。

3.6Western blot實驗 轉(zhuǎn)染后的Capan-2細胞經(jīng)吉西他濱(1 μmol/L)和青蒿琥酯(10 μmol/L)處理48 h后收集細胞，用生理鹽水洗滌2次，用蛋白提取液提取Capan-2細胞中的總蛋白質(zhì)。將等量的總蛋白質(zhì)或3.5所述所得樣品用10% SDS-PAGE進行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉對PVDF進行封閉孵育2 h，之后再將PVDF膜用抗MDM2、p53、Puma、Noxa、caspase-9、caspase-3、cytochrome C、apoptosis-inducing factor和GAPDH抗體孵育過夜。I 抗孵育完畢后的PVDF膜再用帶辣根過氧化物酶的 II 抗孵育2 h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 15.0進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。所有實驗重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組間均數(shù)采用非配對雙側(cè)t檢驗進行分析；多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，再用Bonferroni校正的t檢驗進行多組間均數(shù)兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 青蒿琥酯增強吉西他濱的抗胰腺癌活性

將p53野生型胰腺癌細胞系Capan-2用青蒿琥酯(0～160 μmol/L)進行單獨處理，MTT實驗結(jié)果顯示青蒿琥酯單獨處理對Capan-2細胞的殺傷活性較弱，10 μmol/L青蒿琥酯單獨處理對Capan-2細胞的細胞活力沒有明顯影響,見圖1A，因此將Capan-2細胞用10 μmol/L青蒿琥酯與不同濃度吉西他濱(0～32 μmol/L)進行聯(lián)合處理，研究青蒿琥酯對吉西他濱的輔助效應(yīng)。實驗結(jié)果顯示青蒿琥酯能顯著增強吉西他濱的抗胰腺癌活性(P<0.05)，見圖1B,降低吉西他濱對Capan-2細胞的IC50(P<0.05),見圖1C。流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示青蒿琥酯能明顯促進吉西他濱對Capan-2細胞凋亡的誘導(dǎo)(P<0.05),見圖1D。這些結(jié)果表明青蒿琥酯能顯著增強吉西他濱的抗胰腺癌活性。

Figure 1.Artesunate enhanced the anti-tumor effect of gemcitabine on pancreatic cancer Capan-2 cells. A: the cytotoxicity of artesunate against Capan-2 cells; B: artesunate increased the cytotoxicity of gemcitabine against Capan-2 cells; C: combination treatment with artesunate decreased the IC50 of gemcitabine for Capan-2 cells; D: artesunate increased the gemcitabine-induced apoptosis of Capan-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsgemcitabine group.

圖1青蒿琥酯增強吉西他濱的抗胰腺癌殺傷作用

2 青蒿琥酯對吉西他濱的輔助抗胰腺癌活性依賴于MDM2的抑制

Western blot實驗結(jié)果顯示青蒿琥酯能明顯抑制Capan-2細胞中MDM2的表達水平(P<0.05)，見圖2A，表明MDM2是青蒿琥酯的作用靶點。另外，為了研究MDM2對吉西他濱殺傷胰腺癌活性的影響，我們將MDM2過表達質(zhì)粒或MDM2 siRNA轉(zhuǎn)染入Capan-2細胞中，觀察其效果，MDM2質(zhì)粒和MDM2 siRNA的轉(zhuǎn)染效率見圖2A。MTT實驗結(jié)果顯示盡管青蒿琥酯能明顯提高吉西他濱對Capan-2細胞的殺傷活性，然而轉(zhuǎn)染MDM2質(zhì)粒后，青蒿琥酯對吉西他濱的輔助作用受到明顯抑制(P<0.05);另一方面，轉(zhuǎn)染MDM2 siRNA直接抑制MDM2的表達水平同樣能增強吉西他濱對Capan-2細胞的殺傷活性(P<0.05),見圖2B。這些結(jié)果表明Capan-2細胞中MDM2表達水平對吉西他濱的抗胰腺癌活性起重要作用，青蒿琥酯通過抑制Capan-2細胞中MDM2的表達提高細胞對吉西他濱的敏感性。另一方面，有研究發(fā)現(xiàn)MDM2表達質(zhì)?；騇DM2 siRNA能明顯改變Capan-2細胞中MDM2這一p53內(nèi)源性抑制分子[11]的表達水平，本研究亦發(fā)現(xiàn)單獨轉(zhuǎn)染MDM2表達質(zhì)?；騇DM2 siRNA對p53蛋白水平有顯著影響(P<0.05)，見圖2C。

Figure 2.Artesunate promoted gemcitabine-induced cell death in Capan-2 cells through inhibition of MDM2. A: the effects of artesunate (10 μmol/L), gemcitabine (1 μmol/L),MDM2 siRNA (50 nmol/L) andMDM2 plasmid (2 mg/L) on the expression of MDM2 in the Capan-2 cells; B: the effects of artesunate (10 μmol/L), gemcitabine (1 μmol/L),MDM2 siRNA (50 nmol/L) andMDM2 plasmid (2 mg/L) on the viability of Capan-2 cells; C: the effects ofMDM2 siRNA (50 nmol/L) andMDM2 plasmid (2 mg/L) on the protein level of p53 in the Capan-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsgemcitabine group;&P<0.05vsgemcitabine+artesunate group.

圖2青蒿琥酯通過抑制MDM2表達提高吉西他濱對Capan-2細胞的殺傷活性

3 青蒿琥酯通過MDM2/p53途徑提高Capan-2細胞對吉西他濱誘導(dǎo)的凋亡信號的敏感性

鑒于MDM2是p53的內(nèi)源性抑制分子，誘導(dǎo)p53的降解[11]，我們進一步檢測青蒿琥酯和吉西他濱對p53表達的影響。Western blot實驗結(jié)果顯示青蒿琥酯聯(lián)合吉西他濱能顯著提高Capan-2細胞p53的蛋白水平(P<0.05);同時，青蒿琥酯也能明顯促進吉西他濱處理的Capan-2細胞中Puma和Noxa這2種p53下游調(diào)控蛋白[12]的表達水平(P<0.05),見圖3A。流式細胞術(shù)實驗結(jié)果顯示青蒿琥酯能顯著促進吉西他濱誘導(dǎo)的Capan-2細胞線粒體功能障礙，明顯降低其線粒體膜電位(圖3B)。進一步實驗結(jié)果顯示青蒿琥酯聯(lián)合處理能明顯促進吉西他濱誘導(dǎo)的Capan-2細胞的細胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子從線粒體中釋放到細胞質(zhì)中(圖3C)，進而顯著誘導(dǎo)Capan-2細胞凋亡執(zhí)行蛋白caspase-9和caspase-3的活化(圖3D)。然而，當(dāng)在Capan-2細胞中轉(zhuǎn)染MDM2質(zhì)粒使其強制表達后，青蒿琥酯對吉西他濱誘導(dǎo)的線粒體途徑凋亡的促進作用明顯減弱。這些實驗結(jié)果表明青蒿琥酯能通過MDM2/p53途徑增強吉西他濱對胰腺癌細胞的凋亡誘導(dǎo)活性。

討 論

吉西他濱是臨床上治療胰腺癌的一線化療藥物，因此如何提高吉西他濱的化療療效是目前亟待解決的課題。近期的研究發(fā)現(xiàn)將化療藥物與一些天然藥物活性成分進行聯(lián)合治療能降低腫瘤細胞對化療藥物的抵抗性，有效提高化療藥物的療效[13-14]，因此本研究探討是否可能通過天然藥物聯(lián)合治療途徑提高吉西他濱對胰腺癌細胞的殺傷活性。

在本研究的實驗結(jié)果顯示盡管青蒿琥酯單獨治療的抗胰腺癌活性較弱，但較低濃度的青蒿琥酯(10 μmol/L)卻能明顯增強各種濃度吉西他濱對p53野生型胰腺癌細胞的殺傷活性，表明青蒿琥酯能降低p53野生型胰腺癌對吉西他濱的化療抵抗性，對吉西他濱的化療起到很好的輔助治療作用。

Figure 3.Artesunate increased the sensitivity of Capan-2 cells to the apoptosis signaling induced by gemcitabine. A: artesunate promoted expression of p53, Puma and Noxa in the gemcitabine-treated Capan-2 cells; B: artesunate promoted gemcitabine-induced decrease in mitochondrial membrane potential (MMP) of Capan-2 cells; C: artesunate promoted gemcitabine-induced release of cytochrome C and apoptosis-inducing factor into cytoplasm in Capan-2 cells; D: artesunate promoted gemcitabine-induced activation of caspase-9 and caspase-3 in Capan-2 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsgemcitabine group;&P<0.05vsgemcitabine+artesunate group.

圖3青蒿琥酯增強Capan-2細胞對吉西他濱誘導(dǎo)的凋亡信號的敏感性

野生型p53是一種重要的腫瘤抑制性轉(zhuǎn)錄因子，能通過促進下游靶基因Puma和Noxa[12]的表達誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡。然而，在多種腫瘤細胞中，p53蛋白會發(fā)生表達缺失或突變，使p53蛋白喪失對腫瘤的抑制作用。盡管如此，一些胰腺癌細胞的p53仍以野生型形式存在并發(fā)揮抗腫瘤活性[15]。因此在胰腺癌的治療中，p53是一個潛在的重要靶點。在一般情況下，p53蛋白的穩(wěn)定性和活性受MDM2蛋白的調(diào)控。細胞中的MDM2蛋白能與p53發(fā)生結(jié)合從而抑制p53的生物活性并誘導(dǎo)其發(fā)生降解，因此在一般情況下，胰腺癌細胞中的p53蛋白水平維持在一個較低水平。然而當(dāng)胰腺癌細胞處于化療藥物作用下時，p53蛋白能從MDM2-p53復(fù)合物中游離出來，從而增加了其穩(wěn)定性和細胞內(nèi)蛋白水平[16]。因此，胰腺癌細胞中的p53蛋白水平受細胞中MDM2蛋白和化療藥物的調(diào)控。

在本研究中，我們選擇Capan-2這一p53野生型胰腺癌細胞系來研究蒿琥酯的輔助治療作用。實驗結(jié)果表明青蒿琥酯能明顯降低胰腺癌細胞中MDM2這一p53調(diào)節(jié)性蛋白的表達水平，從而減弱了MDM2對p53的抑制作用，使更多的p53蛋白在吉西他濱依賴的凋亡信號作用下從MDM2-p53復(fù)合物中游離出來。細胞中高水平的p53使Puma和Noxa這些p53下游促凋亡蛋白的表達水平顯著升高，誘導(dǎo)胰腺癌細胞進入線粒體途徑的凋亡，表現(xiàn)為腫瘤細胞線粒體膜電位的顯著下降，線粒體失能，從而使細胞色素C和凋亡誘導(dǎo)因子等凋亡活性分子[17-18]從線粒體中釋放到細胞質(zhì)中，激活細胞的凋亡執(zhí)行蛋白caspase-9和caspase-3，誘導(dǎo)胰腺癌細胞發(fā)生凋亡性死亡。

綜上所述，本研究證明了青蒿琥酯能提高吉西他濱對p53野生型胰腺癌細胞的殺傷活性并研究了其機制。這些研究為提高胰腺癌的化療療效，提高患者的生存能力提供了新的策略和思路。