牟成金， 潘 武， 李 娟， 汪 靜

[1四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院， 四川省人民醫(yī)院(東院)， 四川 成都 610101； 2四川大學(xué)華西醫(yī)院乳腺外科， 四川 成都 610041]

乳腺癌是一種常發(fā)生于女性的惡性腫瘤，其早期的臨床癥狀不明顯，當患者出現(xiàn)一定的臨床癥狀以后大部分已經(jīng)錯過了最佳的治療時機，因此探討乳腺癌的發(fā)病機制，尋找有效的靶基因治療乳腺癌是廣大醫(yī)學(xué)工作者目前研究的重點[1]。組蛋白脫乙酰酶1(histone deacetylase 1，HDAC1)具有調(diào)控細胞生長和凋亡等的作用，其可以影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達，在非組蛋白和組蛋白的乙?；芯哂嘘P(guān)鍵作用[2]。HDAC1參與腫瘤的發(fā)生，在腫瘤中表達異常，例如乳腺癌、腎癌和膀胱癌等，并且HDAC1還可以通過多種途徑調(diào)控腫瘤細胞的凋亡等生物學(xué)特性[3-5]。Wnt/β-catenin在乳腺癌中過度激活，是一種與腫瘤細胞生長、凋亡密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，HDAC1可以通過與Wnt/β-catenin的相互作用影響肝癌細胞的生長[6-7]。本研究探討HDAC1在乳腺癌細胞中的表達和敲減HDAC1對乳腺癌細胞活性和凋亡的影響及機制，為靶向HDAC1治療乳腺癌和研究HDAC1在腫瘤中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 材料

正常乳腺上皮細胞系MCF-10A及乳腺癌細胞系BT549、MCF-7和MDA-MB-231購自ATCC，均用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于95%空氣、5% CO2培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為37 ℃，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代?？辜毎芷诘鞍譊1(cyclin D1)抗體購自Saierbio；抗cleaved caspase-3、β-catenin和c-Myc抗體購自CTS；MMLV-RT逆轉(zhuǎn)錄酶和RT-qPCR試劑盒購自大連寶生物；RNA提取試劑盒購自北京天根；抗HDAC1抗體購自Abcam；HDAC1 siRNA和siRNA control購自Seebio；Lipofectamine 2000購自Invitrogen。

2 方法

2.1RT-qPCR測定HDAC1 mRNA在細胞中的表達 收集正常乳腺上皮細胞系MCF-10A及乳腺癌細胞系BT549、MCF-7和MDA-MB-231，在細胞中分別添加TRIzol裂解液，按照細胞總RNA提取試劑盒說明書提取細胞中的總RNA。用MMLV-RT逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。取cDNA進行RT-qPCR，反應(yīng)程序為：95 ℃ 2 min; 95 ℃ 30 s、60 ℃ 35 s， 40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法分析計算HDAC1在各組細胞中的mRNA水平。HDAC1的上游引物序列為5’-GGGTCAAGGAGGAGGTCAAG-3’， 下游引物序列為5’-TTGGCATTTCAGGAGTTTGTC-3’； GAPDH的上游引物序列為5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’， 下游引物序列為5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’。

2.2Western blot測定蛋白水平 收集正常乳腺上皮細胞系MCF-10A及乳腺癌細胞系BT549、MCF-7和MDA-MB-231，提取細胞中的總蛋白，把各組蛋白加入1/4體積的5×SDS上樣緩沖液中，在100 ℃反應(yīng)5 min。以12%的分離膠和4%的濃縮膠進行電泳，每個泳道中添加30 μg的蛋白樣品，在濃縮膠中以70 V電壓電泳大約30 min后，觀察染料進入到分離膠和濃縮膠的交接處，把電壓調(diào)整到100 V，繼續(xù)電泳約2.5 h，觀察染料進入底端以后，進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件為 4 ℃，300 mA，轉(zhuǎn)膜時間為100 min。用以TBST稀釋的牛血清白蛋白在室溫中封閉60 min。HDAC1 I抗以1∶300稀釋，把封閉后的膜放在稀釋好的 I 抗內(nèi)，置于4 ℃過夜。 II 抗以1∶3 000稀釋，再把膜放在稀釋好的 II 抗中，置于室溫孵育2 h。ECL發(fā)光以后，曝光，用軟件分析各條帶的灰度值，用HDAC1灰度值與GAPDH灰度值的比值表示蛋白水平。Control、siRNA control和HDAC1 siRNA各組的細胞培養(yǎng)48 h以后，按照上述Western blot方法測定細胞內(nèi)cleaved caspase-3、β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白水平。

2.3細胞轉(zhuǎn)染和分組 MDA-MB-231細胞中轉(zhuǎn)染HDAC1 siRNA和siRNA control，轉(zhuǎn)染用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，步驟參照試劑說明書。以不做轉(zhuǎn)染處理的MDA-MB-231細胞為control組。各組細胞在轉(zhuǎn)染以后分別培養(yǎng)48 h，以RT-qPCR和Western blot法測定細胞中HDAC1 的mRNA和蛋白水平，步驟同上。

2.4MTT法測定細胞活力 取種植于96孔板內(nèi)的各組細胞，培養(yǎng)48 h后，在細胞內(nèi)分別添加20 μL的MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h。用移液槍把上清溶液吸除，每孔中分別添加150 μL的DMSO，觀察結(jié)晶物溶解以后，測定各孔490 nm的吸光度(A)值。A值越大表明細胞活力越高。

2.5流式細胞術(shù)測定細胞凋亡 各組細胞培養(yǎng)48 h后，收集細胞，用500 μL的結(jié)合緩沖液重懸，添加Annexin V-FITC和PI分別5 μL，放置于室溫，避光反應(yīng)約15 min，流式細胞儀測定各組乳腺癌細胞凋亡。

2.6激活Wnt/β-catenin信號通路后細胞凋亡情況的檢測 取轉(zhuǎn)染HDAC1 siRNA后的乳腺癌MDA-MB-231細胞，在細胞培養(yǎng)液中添加10 mmol/L的Wnt/β-catenin通路激活劑LiCl， 即HDAC1 siRNA+LiCl組。流式細胞術(shù)測定HDAC1 siRNA+LiCl和HDAC1 siRNA組細胞48 h的凋亡水平，Western blot測定HDAC1 siRNA+LiCl和HDAC1 siRNA組細胞培養(yǎng)48 h后細胞中cleaved caspase-3、β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白水平，步驟同上。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)均用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較均用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，各組間兩兩比較用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HDAC1在乳腺癌細胞中高表達

乳腺癌細胞系BT549、MCF-7和MDA-MB-231中HDAC1的mRNA和蛋白水平均明顯高于正常乳腺上皮細胞系MCF-10A(P<0.05)，說明HDAC1在乳腺癌細胞中過度表達。其中MDA-MB-231細胞中HDAC1的mRNA和蛋白水平均明顯高于MCF-7和BT549細胞(P<0.05)，故選用MDA-MB-231細胞做后續(xù)實驗，見圖1。

2 HDAC1 siRNA下調(diào)乳腺癌細胞中HDAC1的表達

siRNA control組細胞中HDAC1的mRNA和蛋白水平與control組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性;HDAC1 siRNA組細胞中HDAC1 的mRNA和蛋白水平均明顯低于control組(P<0.05)，見圖2。

3 敲減HDAC1表達降低乳腺癌細胞活力并誘導(dǎo)細胞凋亡

siRNA control組細胞的A值與凋亡率與control組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性;HDAC1 siRNA組細胞的A值明顯低于control組，凋亡率明顯高于control組(P<0.05),見圖3。

Figure 1.The expression of HDAC1 at mRNA and protein levels in normal mammary epithelial cell line MCF-10A and breast cancer cell lines BT549, MCF-7 and MDA-MB-231. A: the mRNA expression of HDAC1 determined by RT-qPCR; B: the protein expression of HDAC1 determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsMCF-10A;#P<0.05vsMCF-7 or BT549.

圖1HDAC1在正常乳腺上皮細胞系MCF-10A和乳腺癌細胞系BT549、MCF-7、MDA-MB-231中表達水平的比較

4 敲減HDAC1表達誘導(dǎo)乳腺癌細胞中caspase-3活化并抑制Wnt/β-catenin信號通路激活

siRNA control組細胞中cleaved caspase-3、β-catenin、c-Myc和cyclin D1的蛋白水平與control組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性; 與control組相比，HDAC1 siRNA組細胞中的cleaved caspase-3水平明顯升高，β-catenin、c-Myc和cyclin D1水平明顯降低(P<0.05),見圖4。

5 激活Wnt/β-catenin信號通路抑制HDAC1下調(diào)誘導(dǎo)的乳腺癌細胞凋亡

Figure 2.The effect ofHDAC1 siRNA transfection on HDAC1 expression in the breast cancer cells. A: the mRNA expression of HDAC1 determined by RT-qPCR; B: the protein expression of HDAC1 determined by Wes-tern blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssiRNA control group.

圖2HDAC1siRNA對乳腺癌細胞中HDAC1表達的影響

HDAC1 siRNA+LiCl組細胞的A值明顯高于HDAC1 siRNA組，凋亡率明顯低于HDAC1 siRNA組(P<0.05),見圖5。

6 激活Wnt/β-catenin信號通路減弱HDAC1下調(diào)對細胞中cleaved caspase-3、β-catenin、c-Myc和cyclin D1蛋白水平的影響

與HDAC1 siRNA組相比，HDAC1 siRNA+LiCl組細胞中的cleaved caspase-3水平明顯降低，β-catenin、c-Myc和cyclin D1水平明顯升高(P<0.05),見圖6。

討 論

腫瘤的發(fā)生與組蛋白乙酰化有關(guān)，當正常細胞內(nèi)組蛋白的乙?；叭ヒ阴；降钠胶獗淮蚱埔院螅蜁鸺毎恼４x及生長等發(fā)生異常，引起腫瘤的發(fā)生[8]。組蛋白脫乙酰酶可以將組蛋白去乙?；?，維持乙?；胶?。HDAC1是組蛋白脫乙酰酶家族中的成員，是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤密切相關(guān)的成員之一，在腫瘤的轉(zhuǎn)移和發(fā)生中均有重要作用[9-10]。HDAC1高表達之后，腫瘤細胞的增殖活性明顯增強，HDAC1是所有組蛋白脫乙酰酶中與腫瘤關(guān)系最具有代表性的成員，其表達水平的高低與宮頸癌、肺癌、乳腺癌和胃癌等多種癌癥的進展和分期有關(guān)，并且HDAC1還參與細胞內(nèi)增殖、凋亡等相關(guān)因子的表達[11-17]。本實驗的結(jié)果顯示，HDAC1在3株乳腺癌細胞中的表達水平均明顯高于正常的乳腺上皮細胞，這與上述研究報道一致，HDAC1在乳腺癌中高表達。

研究報道顯示，HDAC1參與腫瘤細胞的有絲分裂，并且可以通過激活caspase-3誘導(dǎo)細胞凋亡的發(fā)生[18]。腫瘤細胞的生長和凋亡是細胞自發(fā)完成的一種主動過程，是經(jīng)過多重基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的嚴格過程[19]。Caspase-3在細胞凋亡中有重要作用，無論是線粒體途徑還是死亡受體途徑，最后都會激發(fā)caspase凋亡反應(yīng)，使位于凋亡反應(yīng)下游的caspase-3激活，促進細胞凋亡[20-21]。本實驗表明，乳腺癌細胞中敲減HDAC1表達后，細胞中caspase-3的活化水平升高，細胞凋亡增加，細胞活性降低，提示敲減HDAC1表達可誘導(dǎo)caspase-3活化，促進乳腺癌細胞凋亡。

Wnt/β-catenin信號通路是一個由多個作用位點和環(huán)節(jié)共同組成的與生長發(fā)育有關(guān)的信號通路，其在成熟的細胞中激活水平極低，細胞內(nèi)的β-catenin存在于細胞膜上，以復(fù)合物的形式存在[22]。在細胞受到相關(guān)信號刺激以后，β-catenin的降解受到抑制，引起細胞內(nèi)β-catenin大量聚集，進入到細胞核內(nèi)，誘導(dǎo)下游靶基因c-myc、cyclinD1的轉(zhuǎn)錄[23]。Wnt/β-catenin信號通路與乳腺癌有關(guān)，不僅參與乳腺癌干細胞的分化增殖，還與乳腺癌細胞的生長凋亡有關(guān)[24]。最近的研究顯示，HDAC1與Wnt/β-catenin存在一定的潛在關(guān)系，對于細胞的生長和凋亡具有調(diào)控作用[25-27]。本實驗結(jié)果表明，敲減HDAC1表達可以抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，而Wnt/β-catenin激活劑可以部分逆轉(zhuǎn)敲減HDAC1表達誘導(dǎo)的乳腺癌細胞凋亡，敲減HDAC1表達通過抑制Wnt/β-catenin信號通路誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡。

Figure 3.The effects ofHDAC1 knockdown on the viability and apoptosis of breast cancer cells. A: the cell viability detected by MTT assay; B: the images of flow cytometry for cell apoptosis and quantitative analysis of the apoptotic rate. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssiRNA control group.

圖3敲減HDAC1表達對乳腺癌細胞活力和凋亡的影響

Figure 4.The effects ofHDAC1 knockdown on the protein levels of cleaved caspase-3, β-catenin, c-Myc and cyclin D1 in the breast cancer cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vssiRNA control group.

圖4敲減HDAC1對乳腺癌細胞中cleavedcaspase-3、β-catenin、c-Myc和cyclinD1蛋白水平的影響

HDAC1在乳腺癌中高表達，敲減HDAC1表達可以誘導(dǎo)乳腺細胞的凋亡，是一種潛在的治療乳腺癌的基因靶點。敲減HDAC1表達可以通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活誘導(dǎo)乳腺癌細胞的凋亡，對于其在其他多株乳腺癌細胞中的作用需要在后續(xù)實驗中進行驗證。本研究結(jié)果對于研究HDAC1在乳腺癌中的作用提供了新的資料。

Figure 5.The effects of activation of Wnt/β-catenin signaling pathway onHDAC1 knockdown-induced apoptosis of the breast cancer cells. A: the cell viability detected by MTT assay; B: flow cytometry was used to analyze cell apoptosis and quantitative analysis of the apoptotic rate. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHDAC1 siRNA group.

圖5激活Wnt/β-catenin信號通路對HDAC1下調(diào)誘導(dǎo)的乳腺癌細胞凋亡的影響

Figure 6.The effects of Wnt/β-catenin signaling pathway activation on the protein levels of cleaved caspase-3, β-catenin, c-Myc and cyclin D1 protein in the breast cancer cells withHDAC1 knockdown determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHDAC1 siRNA group.

圖6激活Wnt/β-catenin信號通路對敲減HDAC1表達的乳腺癌細胞中cleavedcaspase-3、β-catenin、c-Myc和cyclinD1蛋白水平的影響