羅 楊， 童冰杰， 趙 賓， 劉啟歐， 魏玉林， 王淑美

(重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院， 中醫(yī)藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室， 重慶 400016)

肺癌的發(fā)病率和死亡率已經成為世界上惡性腫瘤之首，其中又以非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)尤為顯著，約占所有肺癌的85%[1-2]。大多數(shù)患者確診惡性腫瘤時已經發(fā)生了浸潤或遠處轉移，放、化療及分子靶向治療為其主要治療手段。以吉非替尼(gefitinib)為代表的肺癌分子靶向藥物屬于表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI),對EGFR突變的非小細胞肺癌具有很好的療效，但幾乎所有患者在1 年內都發(fā)生了不同程度的耐藥[1-3]，因此進一步探討EGFR-TKI獲得性耐藥的分子機制和逆轉策略刻不容緩。研究表明，上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與EGFR-TKI耐藥密切相關，逆轉EMT可增強肺癌細胞對EGFR-TKI的敏感性[2-6]。除痰解毒方(Chutan-Jiedu decoction,CJD)是李榮亨教授40多年從大量臨床實踐中總結出來的治療肺癌的有效方劑，全方標本兼顧，共奏除痰解毒抗腫瘤之功。本文通過研究除痰解毒方對人肺腺癌細胞株H1975裸鼠移植瘤EMT相關蛋白E-cadherin、Snail和波形蛋白(vi-mentin)表達的影響，探討其逆轉肺癌靶向耐藥的作用及機制，為除痰解毒方的臨床應用提供實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動物與細胞株

SPF級4～5周齡BALB/c裸小鼠，均為雄性，體質量16～18 g，共66只(6只專用于傳代)，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號為SCXK(京) 2014-0004。人肺腺癌耐藥細胞株H1975由重慶威斯騰生物醫(yī)藥科技有限責任公司惠贈。

2 藥物、試劑和主要儀器

除痰解毒方由廣木香7 g、砂仁7 g、黨參15 g、白術9 g、茯苓15 g、姜半夏5 g、厚樸10 g、陳皮5 g、浙貝母15 g、薏苡仁50 g、紅豆杉3 g、三棱5 g、莪術5 g、威靈仙7 g、仙鶴草15 g、魚腥草15 g和金蕎麥15 g組成，購自重慶醫(yī)科大學附屬第一院中藥房，經重慶醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院何先元教授鑒定為正品，將中藥水煎制成終濃度為2.0 kg/L，4 ℃保存；吉非替尼由阿斯利康公司惠贈；RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone(批號AAL209012)；胎牛血清購自GEMINI(批號A46F82H)；抗E-cadherin、Snail和vimentin 抗體購自Affinity Biosciences(批號2214t00、9613j14和1886q77)；DAB 顯色試劑盒和兔SP檢測試劑盒(批號14188A08)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

Gel Doc 2000N凝膠成像系統(tǒng)、POWER/PAC 1000電泳儀和熒光定量PCR儀(ABI)；核酸蛋白分析儀(Beckman)；低溫離心機(Sigma)。

3 主要方法

3.1動物造模、分組與給藥 將處于對數(shù)生長期的H1975細胞懸液(1×1010/L)接種至 6 只裸鼠背部皮下以供傳代(每只0.2 mL)。用游標卡尺測量瘤塊直徑約7 mm時，麻醉處死裸鼠，剝取腫瘤組織，以無血清培養(yǎng)基制備細胞懸液，調節(jié)濃度為1×1010/L，接種至60 只BALB/c小鼠背側皮下(每只0.2 mL)。用游標卡尺測量瘤塊直徑約5 mm時將60 只荷瘤裸小鼠隨機分為6組：模型(model)組，吉非替尼(0.04 g/kg)組，除痰解毒方低、中、高劑量(13.52 g/kg、27.04 g/kg和54.08 g/kg)組，除痰解毒方中劑量(27.04 g/kg)聯(lián)合吉非替尼(0.04 g/kg)組。每組10只，灌胃，每天1次，連續(xù)14 d。

3.2抑瘤實驗 第15天麻醉后處死裸鼠，稱取瘤質量，測量各組裸鼠移植瘤的最長徑a(cm)和最短徑b(cm)，計算腫瘤體積及抑瘤率。腫瘤體積(cm3)=0.52ab2;抑瘤率(%)=(模型組平均瘤質量-治療組平均瘤質量)/模型組平均瘤質量×100%。

3.3免疫組織化學法檢測E-cadherin、Snail和vi-mentin的表達 各組瘤組織切片后，根據(jù)SP試劑盒說明書進行操作，加抗E-cadherin、Snail和vimentin抗體及II抗后DAB染色及蘇木精復染，烘干，封片。應用 Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖片，選取圖片上具有染料色調的區(qū)域(area)，測量該區(qū)域的積分吸光度(IA)值，選擇并測量有效統(tǒng)計區(qū)域的面積，計算選擇區(qū)域內的吸光度平均值(IA/area)。

3.4Western blot法檢測E-cadherin、Snail和vimentin蛋白的表達 分別采用液氮研磨法和Bradford 法對組織總蛋白進行提取和定量，取60 μg蛋白質行SDS-PAGE分離，移至硝酸纖維素膜上。常規(guī)孵育I抗和II抗，顯影，以GAPDH為內參照檢測蛋白表達。

3.5Real-time PCR法檢測E-cadherin、Snail和vi-mentin的mRNA表達 按照TRIzol試劑說明書提取RNA。以紫外分光光度計A260/A280及瓊脂糖凝膠電泳進行RNA 濃度測定。按逆轉錄試劑盒 (Thermo Fisher Scientific)說明書進行具體操作。根據(jù)GenBank上所查mRNA序列，采用軟件設計引物，以β-actin 作為內參照，引物序列見表1。用ABI StepOnePlus PCR System 軟件分析，計算目的基因的 Ct 值。各目的基因表達水平的差異比較采用2-ΔΔCt法計算。ΔΔCt=(處理組目的基因Ct-處理組內參照基因Ct)-(對照組目的基因Ct-對照組內參照基因Ct)。

表1 Real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，Levene檢驗判斷方差齊性，方差齊時組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗；方差不齊時采用獨立樣本Kruskal-Wallis檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組抑瘤實驗結果的比較

與模型組和吉非替尼組相比，除痰解毒方中、高劑量組及聯(lián)合用藥組的腫瘤體積和質量顯著下降(P<0.05)，抑瘤率分別為48.56%、37.73%和61.92%，見表2。

表2 除痰解毒方對模型小鼠腫瘤生長的的影響Table 2.The effect of Chutan-Jiedu decoction (CJD) on tumor growth in model mice (Mean±SD. n=10)

*P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsgefitinib group.

2 免疫組織化學法檢測各組移植瘤組織中E-cadherin、Snail和vimentin蛋白的表達

E-cadherin和vimentin主要表達于細胞膜和細胞漿，Snail主要表達于細胞核，陽性表達呈黃色或棕黃色。除痰解毒方中劑量組和聯(lián)合用藥組E-cadhe-rin蛋白表達水平顯著上調，Snail和vimentin蛋白表達水平較模型組與吉非替尼組顯著下調(P<0.05)，見圖1～3及表3。

3 Western blot 檢測各組移植瘤組織中E-cadhe-rin、Snail和vimentin蛋白的表達

與模型組比較，吉非替尼組和除痰解毒方低劑量組E-cadherin蛋白的表達差異無統(tǒng)計學顯著性；除痰解毒方中劑量組、除痰解毒方高劑量組及聯(lián)合用藥組E-cadherin蛋白表達水平顯著上調，而Snail和vimentin蛋白表達水平較模型組與吉非替尼組顯著下調(P<0.05)，見圖4。

4 除痰解毒方對各組移植瘤組織中E-cadherin、Snail和vimentin mRNA表達的影響

除痰解毒方中劑量組、除痰解毒方高劑量組及聯(lián)合用藥組E-cadherin mRNA表達水平顯著上調，Snail和vimentinm 的mRNA表達水平較模型組與吉非替尼組顯著下調(P<0.05)，見圖5。

Figure 1.The result of immunohistochemical staining for observing the expression of E-cadherin (SP, ×400).

圖1免疫組織化學法檢測各組腫瘤組織中E-cadherin的表達

Figure 2.The result of immunohistochemical staining for onserving the expression of Snail (SP, ×400).

圖2免疫組織化學法檢測各組腫瘤組織中Snail的表達

Figure 3.The result of immunohistochemical staining for observing the expression of vimentin (SP, ×400).

圖3免疫組織化學法檢測各組腫瘤組織中vimentin的表達

表3免疫組織化學法檢測各組移植瘤瘤組織E-cadherin、Snail和vimentin蛋白的表達

Table 3.The protein expression of E-cadherin, Snail and vimentin was observed by the method of immunohistochemistry in each nude mouse xenografts (Mean±SD.n=10)

GroupE-cadherinSnailVimentinModel0.143±0.0230.367±0.0410.261±0.029Gefitinib0.155±0.0130.354±0.0280.237±0.036Low-dose CJD0.171±0.016*0.321±0.049*△0.226±0.032*Middle-dose CJD0.195±0.011*△0.238±0.027*△0.177±0.029*△High-dose CJD0.176±0.012*△0.279±0.033*△0.210±0.036*Combined medication0.231±0.025*△0.204±0.028*△0.135±0.031*△

*P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsgefitinib group.

討 論

近年來，EGFR-TKI藥物的使用給晚期NSCLC患者帶來了希望，EGFR-TKI藥物已經覆蓋了晚期NSCLC的一線、二線和三線治療。但隨著治療時間的延長，大多數(shù)患者在一年內對EGFR-TKI藥物發(fā)生耐藥，并且病情進一步惡化，雖然研制出了二代和三代EGFR-TKI藥物，但其療效不明確、價格昂貴，難以臨床推廣使用，因此必須研究一種新的治療方案來克服對EGFR-TKI的耐藥[2-4]。對于EGFR-TKI 耐藥機制的研究很多，主要包括 EGFR-T790M突變、旁路激活、MET基因擴增以及EMT等[3-6]。研究證實腫瘤EMT的發(fā)生與EGFR-TKI耐藥密切相關，逆轉EMT的發(fā)生可延緩對EGFR-TKI的耐藥[6-8]。

EMT是以E-cadherin等上皮標志蛋白表達的降低以及vimentin等間充質蛋白表達增多為主要特征，與腫瘤的發(fā)生、腫瘤細胞的原位侵襲和遠處轉移密切相關[9-10]。判斷腫瘤細胞發(fā)生EMT的重要檢測指標有E-cadherin、Snail和vimentin。E-cadherin在維持上皮細胞形態(tài)完整性中發(fā)揮著重要作用，當E-cadherin表達減少或缺失，可使癌細胞從原發(fā)病灶中脫離，向周圍淋巴結轉移或侵入血管向遠處轉移，同時，E-cadherin的表達還會影響肺癌患者靶向藥物的治療效果，有研究表明E-cadherin蛋白表達陽性的NSCLC患者預后較好[4, 9-10]；作為調控EMT的核心轉錄因子Snail，其通過競爭性的結合E-cadherin啟動子區(qū)的E-box序列，抑制上皮標志物E-cadherin的表達，并且能導致vimentin和fibronectin等間充質細胞標志分子的上調或重新分配從而促進EMT發(fā)生[11-12]；vimentin最初是作為間葉性腫瘤的特異性標志物，但逐漸被發(fā)現(xiàn)與患者癌細胞表達與預后相關，廣泛被認為是增強癌侵襲和轉移的必備條件[3-5, 12]。

Figure 4.The images of Western blot and quantitative analysis for determining the protein expression of E-cadherin, Snail and vimentin. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsgefitinib group.

圖4Westernblot檢測E-cadherin、Snail和vimentin的蛋白表達

Figure 5.The mRNA expression of E-cadherin, Snail and vimentin was detected by real-time PCR in each nude mouse xenografts. Mean±SD.n=10.*P<0.05vsmodel group;△P<0.05vsgefitinib group.

圖5Real-timePCR檢測各組移植瘤組織中E-cadherin、Snail和vimentin的mRNA表達

中醫(yī)藥可廣泛應用于肺癌治療的各個階段，有研究表明中藥可協(xié)同提高肺癌對分子靶向藥物療效，對晚期肺癌治療具有重要的臨床意義[13-17]。除痰解毒方中廣木香、砂仁、黨參、白術、茯苓、姜半夏、厚樸、陳皮和甘草健脾理氣化痰；三棱、莪術和浙貝母活血散結化痰；紅豆杉、薏苡仁、魚腥草和金蕎麥清熱解毒散結；威靈仙祛風防轉移；仙鶴草益氣補虛固脫。全方標本兼顧，共奏益氣補虛、健脾化痰、解毒散結、理氣消積、通絡祛風之功。

本研究結果顯示除痰解毒方中、高劑量組能顯著抑制裸鼠移植瘤的生長，促進腫瘤細胞的凋亡，表明除痰解毒方有一定的抗腫瘤作用；單用吉非替尼抑瘤作用不明顯，但聯(lián)合除痰解毒方后其抑瘤作用更加明顯，表明除痰解毒方具有增強靶向藥吉非替尼療效的作用，從而延緩靶向耐藥的發(fā)生；同時，除痰解毒方可不同程度地上調E-cadherin蛋白及mRNA的表達，下調Snail和vimentin蛋白及mRNA的表達，且除痰解毒方聯(lián)合吉非替尼比單獨用藥組效果更佳，說明除痰解毒方聯(lián)合吉非替尼具有協(xié)同增效的作用，除痰解毒方逆轉肺癌吉非替尼耐藥的機制可能與升高E-cadherin蛋白的表達，降低Snail和vimentin的表達有關。本研究結果表明聯(lián)合用藥組比單獨用藥組效果更佳，但其具體機制還不明確，下一步我們將重點研究其是通過何種信號通路來實現(xiàn)協(xié)同增效的作用。