張宇軒， 李春偉， 毛文浩， 朱恪巖， 邵揚謙， 鄧曉明△

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1中西醫(yī)結(jié)合科， 2腫瘤科， 河南 鄭州 450052; 3河南省腫瘤醫(yī)院甲狀腺頭頸外科， 河南 鄭州 450008)

非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的80%～85%左右，由于其早期癥狀不明顯，患者被發(fā)現(xiàn)時往往已處于晚期[1-2]。目前，針對NSCLC的主要治療手段為手術(shù)、化療和放療[3-4]。然而與小細胞肺癌相比，NSCLC具有對放療和化療相對不敏感的特點，盡管極大程度地發(fā)展放化療手段，患者5年存活率仍低于15%[5]。因此，需要大力推進相關(guān)科學(xué)研究以提高對NSCLC的診斷以及治療水平。

微小RNA(microRNA,miRNA，miR)是一種長度大約為22 nt的小分子單鏈非編碼RNA，可與下游靶基因mRNA的3’-UTR結(jié)合，從而促進其發(fā)生降解或者抑制翻譯過程[6]。隨著對miRNA的深入研究，人們提出miRNA的異常表達模式可被作為具有特異性的臨床診斷和治療預(yù)后生物標志物[7]。除此之外，miRNA還可以通過對靶基因的調(diào)控而影響致癌基因或腫瘤抑制因子的活性，與腫瘤的發(fā)生進程息息相關(guān)[8]。文獻報道m(xù)iR-140-3p在多種腫瘤中呈現(xiàn)低表達的現(xiàn)象，在肺癌組織中同樣表達下調(diào)[9-10]。程序性細胞死亡配體1(programmed cell death ligand 1，PD-L1)與機體免疫應(yīng)答息息相關(guān)，在腫瘤免疫逃逸中扮演著重要角色。因此，本研究將探討miR-140-3p和PD-L1對NSCLC細胞活力、遷移和侵襲的影響及其具體作用機制，為后續(xù)研究NSCLC的診斷及治療提供科學(xué)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

人胚肺成纖維細胞HLF-1及肺癌細胞A549和H1299購自北京北納生物。pcDNA3.0質(zhì)粒購自淼靈生物；BCA定量、RNA提取和反轉(zhuǎn)試劑盒購自Thermo；TB Green定量試劑購自TaKaRa；胎牛血清和0.25%胰蛋白酶購自Gibco；MTT試劑盒購自上海歌凡生物；兔抗PD-L1和GAPDH單抗購自Abcam；HRP標記的羊抗兔 II 抗購自Cell Signaling Technology；Lipofectamine 2000 購自Invitrogen；Transwell小室購自Corning；miR-140-3p模擬物(mimic)和抑制劑(inhibitor)購自上海吉瑪生物；引物由上海生工合成。

2 實驗方法

2.1細胞培養(yǎng) 細胞培養(yǎng)于5% CO2、90%相對濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱，細胞貼合度為70%～80%使用0.25%胰蛋白酶消化傳代培養(yǎng)。

2.2RT-qPCR檢測細胞內(nèi)miR-140-3p和PD-L1的表達水平 取生長狀態(tài)良好的HLF-1、A549和H1299細胞，TRIzol法提取細胞內(nèi)總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，RT-qPCR法檢測miR-140-3p和PD-LI mRNA的表達水平。PD-L1上游引物序列為5’-TGACGAGCACACTGAGAA-3’,下游引物序列為5’-AAGGC-AGAATAAGATGGC-3’; GAPDH的上游引物序列為5’-AAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC-3’，下游引物序列為5’-GGGGTCATTGATAACAACAATA-3’；U6的上游引物序列為 5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物序列為5’-CGCTT CACGAATTTGCGTGTCAT-3’; miR-140-3p的上游引物序列為5’-ACACTCCAGCTGGGAGGC-3’，下游引物序列為5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’。以采用2-ΔΔCt法計算miR-140-3p的表達水平。

2.3脂質(zhì)體介導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)染 將A549細胞按每孔2×105個接種于6孔板，過夜貼壁后，按照Lipofectamine 2000操作說明書轉(zhuǎn)染miR-140-3p mimic、miR-140-3p inhibrtor及相應(yīng)的mimic control和inhi-bitor control，培養(yǎng)相應(yīng)時間后進行后續(xù)實驗。同時構(gòu)建過表達PD-L1的pcDNA3.1質(zhì)粒，利用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PD-L1及對照空載質(zhì)粒。

2.4雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?以健康人DNA為模板，PCR擴增miR-140-3p與PD-L1結(jié)合區(qū)域WT-3’-UTR和PD-L1-MUT-3’-UTR的DNA片段,將PCR產(chǎn)物分別與pMIR-REPORT luciferase報告載體分別用SpeⅠ和HindⅢ雙酶切后純化，連接，轉(zhuǎn)化，鑒定，獲得PD-L1的含WT-3’-UTR以及MUT-3’-UTR螢光素酶報告質(zhì)粒。將其分別與miR-140-3p模擬物或抑制劑共轉(zhuǎn)染A549細胞48 h，使用Promega公司雙螢光素酶活性檢測試劑盒按說明書在單光子檢測儀中檢測細胞螢光素酶活性。相對螢光素酶活性=螢火蟲螢光素酶活性值/海腎螢光素酶活性值。

2.5Western blot分析 收集轉(zhuǎn)染miR-140-3p模擬物和抑制劑的A549細胞，加入裂解液在低溫條件下反應(yīng)1 h，之后12 000 r/min離心10 min收集細胞上清液，使用BCA法檢測上清總蛋白濃度。加入5×loading buffer，沸水處理10 min，每個點樣孔中加入50 μg蛋白，90 V電泳30 min，120 V繼續(xù)電泳至溴酚藍條帶遷移至底部。100 V、低溫轉(zhuǎn)膜45 min，使用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入1∶1 000稀釋比例的 I 抗4 ℃封閉過夜，加入1∶5 000濃度的 II 抗室溫反應(yīng)2 h，DAB法進行顯色反應(yīng)，并對蛋白條帶進行灰度分析。

2.6MTT實驗檢測細胞活力 取分別轉(zhuǎn)染了miR-140-3p模擬物和pcDNA3.0-PD-L1質(zhì)粒的A549細胞單懸液，按照每孔5×104個的密度接種于96孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后加入20 μL 5 g/L的MTT，37 ℃孵育4 h。去除上清，加入150 μL DMSO溶液避光反應(yīng)10 min，使用酶標儀于490 nm處檢測吸光度(A)值。

2.7Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 取轉(zhuǎn)染miR-140-3p模擬物和pcDNA3.0-PD-L1質(zhì)粒48 h后的A549細胞單懸液，加入無血清培養(yǎng)基后按照每孔5×103個的密度接種于上層腔室，在下層培養(yǎng)基中加入含有10%的胎牛血清的培養(yǎng)基。37 ℃孵育培養(yǎng)24 h后，使用棉簽從上層腔室中轉(zhuǎn)移未發(fā)生遷移和侵襲的細胞，其余細胞從下層腔室轉(zhuǎn)移。之后，將得到的細胞使用0.1%的結(jié)晶紫染液染色30 min，PBS沖洗3次后使用33%乙酸低溫孵育10 min，測量570 nm處的吸光度值并計算遷移細胞個數(shù)。侵襲實驗在上層腔室加入無血清培養(yǎng)基稀釋過的終濃度為1 g/L的基質(zhì)膠100 μL，置于37℃培養(yǎng)箱中待其凝固，后續(xù)操作同遷移實驗。每組3個重復(fù)，與miRNA對照組相比較，計算細胞相對數(shù)值。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件分析處理。計量資料以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 miR-140-3p在非小細胞肺癌細胞系中低表達

RT-qPCR檢測了HLF-1、A549和H1299細胞中miR-140-3p的表達水平，結(jié)果顯示，與HLF-1細胞相比，非小細胞癌A549和H1299細胞中miR-140-3p表達水平顯著下調(diào)(P<0.05)，見圖1。因此后續(xù)研究選擇A549細胞作為研究對象。

Figure 1. The expression of miR-140-3p in different cell lines detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHLF-1.

圖1RT-qPCR檢測miR-140-3p在不同細胞系的表達情況

2 miR-140-3p靶向調(diào)控PD-L1

在線軟件TargetScan分析發(fā)現(xiàn)PD-L1是miR-140-3p的潛在靶標，見圖2A。為驗證兩者之間的靶向調(diào)控關(guān)系，本研究進行了雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灢⑹褂肳estern blot檢測了miR-140-3p對PD-L1蛋白表達的影響。將miR-140-3p模擬物或抑制劑與PD-L1 WT-3’-UTR或MUT-3’-UTR共轉(zhuǎn)染A549細胞，36 h后檢測細胞的相對螢光素酶活性。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染miR-140-3p模擬物和PD-L1 MUT-3’-UTR組相比，轉(zhuǎn)染miR-140-3p模擬物和PD-L1 WT-3’-UTR的螢光素酶活性顯著下調(diào)(P<0.05)；與轉(zhuǎn)染miR-140-3p抑制劑和PD-L1 MUT-3’-UTR組相比，轉(zhuǎn)染miR-140-3p抑制劑和PD-L1 WT-3’-UTR的螢光素酶活性顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖2B。Wes-tern blot結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-140-3p模擬物后，A549細胞內(nèi)PD-L1的表達水平顯著下調(diào)；轉(zhuǎn)染miR-140-3p抑制劑后，PD-L1表達量顯著回升(P<0.05)，見圖2C。以上實驗表明，PD-L1基因受到miR-140-3p的靶向負調(diào)控作用。

3 過表達miR-140-3p抑制A549細胞的活力

將miR-140-3p模擬物轉(zhuǎn)染進入A549細胞，RT-qPCR檢測miR-140-3p模擬物效率，MTT法檢測其對細胞活力的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-140-3p模擬物組miR-140-3p相對表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖3A；并且miR-140-3p表達量的提高對A549細胞的生長具有抑制作用(P<0.05)，見圖3B。

4 過表達miR-140-3p抑制A549細胞遷移和侵襲

A549細胞轉(zhuǎn)染miR-140-3p后，Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力的變化。與轉(zhuǎn)染對照組相比，miR-140-3p模擬物組的細胞遷移和侵襲個數(shù)均顯著降低(P<0.05)，由此可見，A459細胞內(nèi)過表達miR-140-3p能夠顯著抑制遷移和侵襲能力，見圖4。

5 PD-L1阻斷miR-140-3p對A549細胞的抑制

為明確miR-140-3p和PD-L1的具體作用機制以及對A549細胞的影響，將pcDNA3.0-PD-L1質(zhì)粒與miR-140-3p mimic共轉(zhuǎn)染A549細胞，用MTT法檢測其對細胞活力的影響，Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力的變化。Transwell實驗結(jié)果顯示，與miR-140-3p mimic組和miR-140-3p mimic+vector組相比，miR-140-3p mimic+pcDNA3.0-PD-L1組的細胞遷移和侵襲個數(shù)均明顯增多(P<0.05)，見圖5A。MTT實驗結(jié)果顯示，與miR-140-3p mimic組相比，pcDNA3.0-PD-L1和miR-140-3p mimic共轉(zhuǎn)染組的細胞活力得到提高(P<0.05)，見圖5B。以上結(jié)果說明了過表達PD-L1能夠阻斷miR-140-3p對A549細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。

Figure 2.Verification of the target relationship between miR-140-3p and PD-L1.A: TargetScan software prediction; B: dual-lucife-rase receptor assay comfirmed the target relationship; C: Western blot was performed to detect the protein level of PD-L1. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic control group;#P<0.05vsinhibitor control group.

圖2miR-140-3p與PD-L1靶向關(guān)系的驗證

Figure 3.The effect of over-expression of miR-140-3p on the viability of A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic control group.

圖3過表達miR-140-3p對A549細胞活力的影響

Figure 4.The effects of miR-140-3p over-expression on the migration (A) and invasion (B) abilities of A549 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmimic control group.

圖4過表達miR-140-3p對A549細胞遷移和侵襲的影響

討 論

肺癌是常見致死腫瘤之一，其在我國的發(fā)病率和致死率均居首位，對國民健康有著巨大威脅[2,11]。非小細胞肺癌占肺癌總類型的80%以上，主要病理組織類型為腺癌和鱗癌[12]。目前，因發(fā)病的隱蔽性，大部分就診患者被發(fā)現(xiàn)時已屬晚期，治療效果和預(yù)后差，5年生存率極低，因此急需提出一種新的治療手段提高患者生存率[13]。近些年來，關(guān)于腫瘤的免疫治療相關(guān)科學(xué)研究取得了巨大進步，研究者發(fā)現(xiàn)免疫系統(tǒng)不僅能夠參與監(jiān)管和清除腫瘤細胞，而且在特定的階段還能夠促進腫瘤發(fā)生免疫逃逸，因此在機體腫瘤發(fā)生進程扮演重要角色[14]。

PD-1是B7-CD28免疫球蛋白家族成員之一，在活化的CD4+T、CD8+T和B細胞等均有表達，與機體的免疫應(yīng)答息息相關(guān)[9, 15-16]。正常情況下，效應(yīng)T細胞的活化需要TCR和APC表面的共刺激分子結(jié)合，而此時機體內(nèi)的共刺激分子和共抑制分子的水平保持在一定的平衡穩(wěn)態(tài)，從而使T細胞的免疫功能維持在恰當?shù)乃剑饶茏钃蹩乖那趾τ帜軠p少對機體自身的組織損傷。然而，腫瘤可通過異常的代謝調(diào)控共抑制分子和相關(guān)配體的表達活性，例如PD-1的配體PD-L1和PD-L2，從而抑制T細胞的免疫功能，造成腫瘤對免疫系統(tǒng)監(jiān)管的躲避，導(dǎo)致并促進腫瘤的發(fā)生[15, 17-19]。研究表明，PD-L1在多種惡性腫瘤中均出現(xiàn)高表達[20-22]，另外PD-L1 作為單獨的靶點，其表達水平高低與腫瘤細胞的生物學(xué)特性以及腫瘤的預(yù)后存在相關(guān)性[23]。Thompson等[24]通過對196腎癌腫瘤組織樣品分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1的上調(diào)表達能夠促進腫瘤的轉(zhuǎn)移能力并且能夠提高4.5倍的死亡風險。由此可見，PD-L1活性的抑制是阻礙腫瘤發(fā)生免疫逃避的重要手段之一。

大量研究表明miRNA參與細胞分化、生長和凋亡等多種生物學(xué)過程[25]，其中miR-140-3p被報道在多種癌癥中均出現(xiàn)下調(diào)表達，包括非小細胞肺癌[26-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-3p在肺癌A549和H1299細胞中表達顯著下調(diào)，與上訴文獻報道一致。通過TargetScan分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1是miR-140-3p的潛在靶標，并且雙螢光素酶實驗證實了靶向關(guān)系。將miR-140-3p模擬物轉(zhuǎn)染A549細胞后，PD-L1表達下調(diào)，對細胞活力和遷移侵襲能力具有抑制作用；將miR-140-3p模擬物和pcDNA3.0-PD-L1共轉(zhuǎn)染A549細胞發(fā)現(xiàn)，miR-14-3p對細胞活力和遷移侵襲能力的抑制作用得到解除，表明PD-L1能夠阻斷miR-140-3p對A549細胞的抑制。

綜上所述，miR-140-3p和PD-L1的異常表達與非小細胞肺癌有著重要聯(lián)系，本研究主要探討了兩者之間的作用關(guān)系以及在非小細胞肺癌中的作用機制，并證實了miR-140-3p可通過靶向PD-L1抑制A549細胞活力、遷移和侵襲。然而，本研究雖然從生物學(xué)現(xiàn)象上揭示了腫瘤細胞微環(huán)境下PD-L1對A549細胞遷移侵襲的影響和作用，為PD-L1靶點治療提供理論支持，但是關(guān)于PD-L1的參與遷移侵襲具體機制尚不清楚，仍需進一步深入研究。

Figure 5.The effects of PD-L1 over-expression on the viability, migration and invasion of A549 cells. A: the migration and invasion abilities were detected by Transwell assay; B: the cell viability was detected by MTT assoy. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsmiR-140-3p mimic group;#P<0.05vsmiR-140-3p+vector group.

圖5過表達PD-L1對A549細胞活力、遷移和侵襲的影響