張 琎， 高 星， 曹開宇， 肖黎明， 趙元琳， 楊 瑩， 楊日升， 葉 菁

(空軍軍醫(yī)大學基礎醫(yī)學院病理學教研室， 陜西 西安 710032)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝臟最常見的惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌的91.5%，其發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第5位和第3位[1]。肝細胞癌的發(fā)生與癌基因或抑癌基因表達異常、細胞代謝紊亂、慢性病毒感染和不良環(huán)境持續(xù)刺激等多種因素密切相關[2]。作為代謝活躍的器官，肝臟代謝紊亂導致中間產(chǎn)物和活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)積累，其能夠誘發(fā)氧化應激(oxidative stress)，并導致腫瘤相關的遺傳和表觀遺傳改變，被認為是肝細胞癌發(fā)生的重要危險因素。與正常細胞一樣，肝癌細胞的增殖也依賴于脂質(zhì)合成，并需要脂質(zhì)氧化分解提供能量。研究發(fā)現(xiàn)，細胞內(nèi)脂肪酸和膽固醇合成代謝與肝細胞癌的遷移和侵襲密切相關[3]。

脂滴包被蛋白5(perilipin 5，Plin5)是包括脂滴包被蛋白(perilipin)、脂肪分化相關蛋白(adipose differentiation-related protein，ADRP)和47 kD尾連蛋白(tail-interacting protein of 47 kD，TIP47)的PAT家族的重要成員。Plin5特異性地表達于脂肪酸氧化速度較快的組織，如肝臟、心臟、骨骼肌和棕色脂肪組織(brown adipose tissue，BAT)等[4]。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，Plin5缺失可以導致肝細胞ROS水平升高，誘發(fā)細胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化損傷[5]。但是，在肝細胞癌中Plin5表達水平的變化及其對腫瘤細胞生物學行為的影響尚不清楚。

細胞內(nèi)過量生成的ROS能夠?qū)е翫NA、脂質(zhì)和蛋白的異常修飾[6]，參與腫瘤的發(fā)生，并影響腫瘤的生物學行為[7]。本研究通過對臨床肝細胞癌組織分析，探究Plin5等脂滴相關蛋白的表達與肝細胞癌分化程度的關系，并通過在肝細胞癌HepG2中過表達Plin5，探討其對肝細胞癌氧化應激和生物學行為的影響。

材 料 和 方 法

1 病例收集

實驗組石蠟包埋肝細胞癌組織來源于空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院2017年3月～2017年11月的手術標本，對照組正常肝組織主要來源于由外傷等因素導致的肝臟手術標本。根據(jù)HE染色結果對45例臨床病例進行分類，組織標本分為大致正常肝臟組織5例、低分化肝細胞癌11例、中分化肝細胞癌13例和高分化肝細胞癌16例，病理診斷均由2名以上高年資病理醫(yī)生逐一明確。所有病例均排除慢性肝炎病毒感染以及膽管細胞癌，本實驗符合空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的相關規(guī)定。40例肝細胞癌患者臨床病理特點見表1。

表140例肝細胞癌患者臨床病理特點

Table 1.Clinicopathological characteristics of 40 hepatocellular carcinoma patients

Characteristics DataSex Male33 Female7Age (year)31～72Size of tumor <5 cm33 ≥5 cm7Pathological pattern Well-differentiated HCC16 Moderately-differentiated HCC13 Poorly-differentiated HCC11Site of primary tumor Left lobe9 Right lobe31Lymph node metastasis N06 N11 Nx33

2 實驗材料

石蠟包埋組織RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix Perfect Real-Time反轉錄試劑盒及SYBR Premix Ex Taq II購自TaKaRa；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、4-羥基壬烯醛(4-hydroxynonenal，4-HNE)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒購自Cell Biolabs;甘油三酯測定試劑盒及膽固醇測定試劑盒購自Wako；抗鼠Plin5單克隆抗體和過表達Plin5的腺病毒由本實驗室制備；快捷型酶標羊抗鼠IgG抗體和DAB顯色試劑盒購自邁新公司；HepG2細胞培養(yǎng)采用DMEM細胞培養(yǎng)液(購自Gibco),含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS;購自ExCell Bio)、1×105U/L青霉素和0.1 g/L鏈霉素(購自Solarbio)。

3 方法

3.1免疫組織化學染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，并浸入Tris-EDTA緩沖液，采用高壓鍋進行抗原修復，自來水冷卻至室溫；滴加3% H2O2甲醇溶液室溫30 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。采用羊血清37 ℃封閉1 h，滴加抗鼠Plin5抗體(1∶100)，4 ℃孵育過夜；室溫復溫1 h后，PBS洗滌切片3次；滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 II 抗，室溫繼續(xù)孵育1 h；PBS洗滌切片3次后，采用DAB顯色，自來水流水清洗，蘇木精復染30 s，常規(guī)分化，切片經(jīng)脫水、透明和封片后，采用Olympus BX5顯微鏡觀察，并照相。染色強度評分標準：陰性(-)為0分，弱陽性(+)為1分，中等陽性(++)為2分，強陽性(+++)為3分。

3.2石蠟組織RNA提取及RT-qPCR分析 切取數(shù)片10 μm的石蠟包埋組織，放入1.5 mL的EP管中，加1 mL二甲苯，按照石蠟包埋組織總RNA提取試劑盒(天根)說明書進行后續(xù)操作。反轉錄使用TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Master Mix Perfect Real-Time反轉錄試劑盒，將總RNA反轉錄成cDNA。取1 μL cDNA作為模板采用熒光定量試劑SYBR Premix Ex Taq II進行qPCR反應，以GAPDH作為內(nèi)參照。Plin5的上、下游引物分別為5’-GATCACTTCCTGCCCATGAC-3’和5’-CACCGAACCCACTTCAGG-3’, GAPDH的上、下游引物分別為5’-AAGGTGAA-GGTCGGAGTCAAC-3’和5’-GGGGTCATTGATGGCA-ACAATA-3’。每個基因設3個復孔，反應結束后，觀察擴增曲線及熔解曲線，記錄Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt方法計算相對mRNA含量。

3.3BODIPY 493/503染色 在12孔板中先加入滅菌的蓋玻片，每孔接種1×105HepG2細胞，采用含10% FBS的高糖(4.5 g/L glucose)DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。分別采用表達Plin5的腺病毒(Ad-Plin5)和對照腺病毒(Ad-Null)感染HepG2細胞(MOI=50)。培養(yǎng)24 h后，加入終濃度200 μmol/L 油酸(oleic acid，OA; Sigma)促進細胞脂質(zhì)合成，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，PBS洗蓋玻片3次，4%多聚甲醛固定30 min。每孔加入BODIPY 493/503熒光染料(Invitrogen)至終濃度為0.1 mg/L，37 ℃避光染色5 min。PBS清洗3次,每次5min后，每孔加入Hoechst染料(Sigma)至終濃度為1 mg/L，37 ℃避光孵育2 min。PBS清洗后，采用熒光封片劑將蓋玻片封片于載玻片，Olympus BX71型熒光顯微鏡觀察并照相。

3.4細胞內(nèi)脂質(zhì)的定量分析 HepG2細胞接種60 mm培養(yǎng)皿，分別利用Ad-Plin5和Ad-Null感染細胞(MOI=50)，并采用200 μmol/L OA 處理24 h。采用1 mL PBS收集細胞，并利用正己烷/異丙醇(3∶2)溶液抽提細胞總脂類，氮氣干燥后，溶于200 μL含2% Triton X-100的PBS。細胞內(nèi)TG和Chol的定量采用試劑盒(Wako)，并按照試劑盒說明書進行。

3.5脂質(zhì)過氧化和SOD活性的分析 HepG2細胞的培養(yǎng)、感染和油酸處理同前。肝癌細胞中MDA和4-HNE含量，以及SOD活性測定依據(jù)相應檢測試劑盒說明書進行。

3.6細胞劃痕實驗 采用細胞劃痕實驗測定Plin5對HepG2細胞遷移速度的影響。在6孔板中，每個孔接種3×105個細胞，使用Ad-Plin5和Ad-Null腺病毒(MOI=50)感染，37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)24 h。用加樣頭做直線劃痕，用PBS洗貼壁細胞3次，去除劃下的細胞，加入新鮮無血清的DMEM培養(yǎng)液；48 h后在Olympus BX53型顯微鏡下觀察并照相，對比細胞的遷移速度。

3.7Transwell小室實驗 分別采用無或有Matrigel的Transwell小室，分析Plin5對HepG2細胞遷移和侵襲的影響。選擇8.0 μm孔徑的Transwell小室，將Matrigel放于4 ℃溶解，每個小室底部加80 μL Matrigel，37 ℃使其凝固。將有或無Matrigel的小室置于24孔培養(yǎng)板中，下室加500 μL含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，上室分別加入5×104個過表達Plin5或?qū)φ誋epG2細胞，培養(yǎng)液采用100 μL含2% FBS的DMEM培養(yǎng)液，37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，用無鈣的PBS洗2遍，4%多聚甲醛固定30 min，PBS洗2遍。0.1%結晶紫染色20 min，去除基質(zhì)膠和沒有侵襲的細胞，在倒置顯微鏡下觀察移至下室的細胞數(shù)量，在100倍視野下隨機計數(shù)6個視野的細胞數(shù)，再計算每個視野的平均細胞數(shù)，分析Plin5對HepG2細胞遷移和侵襲能力的影響。

3.8CCK-8實驗檢測細胞活力 HepG2細胞以每孔1×103的濃度接種到96孔板，常規(guī)培養(yǎng)12 h后，用過表達Plin5的腺病毒Ad-Plin5或陰性對照Ad-Null病毒感染細胞(MOI=50)。用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)，在37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)到指定的時間，每孔加入10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，利用酶標儀測定450 nm的吸光度(A)值，然后根據(jù)A值分析Plin5對HepG2細胞活力的影響。

4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，計量資料組間的統(tǒng)計學顯著性檢驗采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 人肝細胞癌組織中Plin5的表達水平

我們用免疫組織化學染色檢測了不同級別人肝細胞癌組織中Plin5的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)與正常肝組織比較，肝細胞癌組織中的Plin5表達水平顯著下降，且低分化肝細胞癌表達水平最低(P<0.05或P<0.01)，見圖1A。同時，RT-qPCR結果也顯示，人肝癌組織中Plin5的mRNA含量降低，且隨著分化程度降低，Plin5的mRNA降低更為明顯(P<0.05)，見圖1B。以上結果說明，Plin5在人肝癌組織中表達水平降低。

Figure 1.The expression of Plin5 in human hepatocellular carcinoma (HCC) tissues. A: the sections of the human liver tissues were prepared and subjected to immunohistochemical staining for visualizing the expression of Plin5; B: the relative mRNA level of Plin5 in the human liver tissues was detected by RT-qPCR. Normal liver (n=5), well-differentiated HCC (n=16), moderately-differentiated HCC (n=13) and poorly-differentiated HCC (n=11) groups were included. Mean±SD.*P<0.05,**P<0.01vsnormal liver group.

圖1人肝癌組織中Plin5的表達水平

2 Plin5過表達對HepG2肝癌細胞活力、遷移和侵襲能力的影響

為了進一步研究Plin5對肝細胞活力的影響，我們通過腺病毒感染，在肝細胞癌HepG2中過表達Plin5，并利用CCK-8法檢測了過表達Plin5對HepG2細胞活力的影響。細胞生長曲線顯示， Plin5過表達48 h組較Ad-Null感染對照組生長速度降低(P<0.05)，過表達Plin5 72 h的HepG2細胞生長速度顯著降低(P<0.01)，見圖2。

細胞劃痕實驗結果顯示，感染48 h后Ad-Plin5組較Ad-Null組細胞遷移面積顯著降低(P<0.01)，見圖3A，表明Plin5過表達能夠抑制HepG2細胞的遷移速度，Transwell小室實驗也同樣驗證了這一結論(P<0.05)，見圖3B。利用預鋪Matrigel的Transwell小室實驗，我們還發(fā)現(xiàn)Plin5過表達可降低肝癌細胞的侵襲能力(P<0.01)，見圖3B。這些結果表明，Plin5過表達可以抑制HepG2肝癌細胞的活力、遷移和侵襲。

Figure 2.The CCK-8 assay results showed the influence of Plin5 overexpression on the viability of HepG2 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vsAd-Null group.

圖2Plin5過表達對HepG2細胞活力的影響

3 Plin5過表達對HepG2肝癌細胞中脂質(zhì)含量和氧化應激的影響

用Plin5過表達的腺病毒Ad-Plin5和對照腺病毒Ad-Null感染肝癌HepG2細胞，BODIPY 493/503染色結果顯示，Plin5過表達能夠增加HepG2細胞中脂滴的數(shù)量和體積，尤其是在利用200 μmol/L油酸刺激后，過表達Plin5的HepG2細胞中脂滴數(shù)量和體積增加更為明顯，見圖4A。同時，脂質(zhì)定量分析結果顯示，Plin5能夠顯著增加HepG2細胞中甘油三酯含量(P<0.05)，但對總膽固醇含量沒有顯著影響，見圖4B。這些結果提示，Plin5能夠促進肝癌細胞中脂質(zhì)的蓄積。

4 Plin5過表達對HepG2細胞中的氧化應激水平的影響

Plin5過表達顯著抑制HepG2細胞MDA和4-HNE水平(P<0.05)，上調(diào)SOD活性(P<0.05)，表明Plin5過表達能夠抑制肝癌細胞氧化應激水平，見圖5。

Figure 3.Plin5 overexpression attenuated the migration and invasion abilities of HepG2 cells. A: wound-healing assay was performed to illustrate the effect of Plin5 overexpression on the migration area of HepG2 cells. B: Transwell migration assay and invasion assay were performed to detect the migration and invasion abilities of HepG2 cells. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsAd-Null group.

圖3Plin5過表達對HepG2細胞遷移和侵襲能力的影響

Figure 4.Plin5 overexpression increased the lipid content in HepG2 cells. A: BODIPY 493/503 staining; B: triglyceride and cholesterol levels. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsAd-Null group.

圖4Plin5過表達對HepG2細胞中脂質(zhì)蓄積的影響

Figure 5.The changes of MDA and 4-HNE relative levels and SOD activity in the Plin5-overexpressing HepG2 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsAd-Null group.

圖5Plin5過表達對HepG2細胞中MDA和4-HNE含量以及SOD活性的影響

討 論

脂質(zhì)代謝紊亂與肝細胞癌的發(fā)生密切相關，脂肪酸不僅能夠提供腫瘤細胞增殖所需的脂質(zhì)和能量，其代謝紊亂能夠影響肝癌細胞的生物學行為。在肝癌細胞中，脂質(zhì)代謝紊亂產(chǎn)生的氧化應激，能夠進一步促進肝癌的發(fā)生。在細胞發(fā)生氧化應激的過程中，細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生過多，包括超氧陰離子、羥自由基和過氧化氫等，同時氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，能夠?qū)е录毎鞍?、DNA和RNA的大分子修飾異常，從而促進腫瘤的進展，影響化療藥物的作用。細胞內(nèi)也存在著抗氧化的機制，如SOD、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶，抑制氧化應激反應。在肝臟中，脂質(zhì)超負荷會引起嚴重的細胞氧化還原失衡，導致不同慢性肝病的惡化，主要是通過影響與肝細胞生長因子及其受體c-Met依賴性的谷胱甘肽穩(wěn)態(tài)損傷有關[8]。此外，膽固醇代謝異常造成的氧化應激和細胞功能障礙也被認為是肝細胞癌的重要誘發(fā)因素[9]。

在細胞內(nèi)，過量的脂肪酸通常以甘油三酯的形式儲存在脂滴中。作為脂質(zhì)代謝活躍的器官，肝臟的肝細胞中存在大量的脂滴，這些脂滴在維持肝細胞正常生理功能具有重要的意義。Plin5是perilipin家族的重要成員，是調(diào)控肝細胞脂質(zhì)代謝的重要分子。在Plin5缺失的肝細胞中，脂滴表面的脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)活性顯著增加，導致細胞內(nèi)游離脂肪酸含量增加，促進了脂肪酸的氧化速度，導致大量ROS的產(chǎn)生，從而誘發(fā)肝臟脂毒性(lipotoxicity)損傷[5]。相對于正常肝細胞，肝癌細胞中的脂滴數(shù)量顯著減少，但其發(fā)生機制尚不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn)，在肝細胞癌組織中Plin5表達顯著降低，提示了Plin5的降低可能與肝細胞癌中脂質(zhì)減少有關。為了明確Plin5對肝細胞癌脂質(zhì)代謝的影響，我們發(fā)現(xiàn)過表達Plin5能夠增加HepG2肝癌細胞中的脂滴數(shù)量和脂質(zhì)含量。目前研究發(fā)現(xiàn)，脂質(zhì)代謝過程與肝細胞癌的增殖和遷移密切相關[3]，脂質(zhì)代謝過程中的關鍵分子，如固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白、脂肪酸合成酶、ATP檸檬酸裂解酶、乙酰輔酶A羧化酶、甲羥戊酸激酶和3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶等，均能夠顯著促進致瘤過程，并增加腫瘤的侵襲性[10-11]。我們的研究結果還顯示，Plin5的過表達可以抑制肝癌細胞的遷移和增殖，可能是與Plin5的過表達降低肝臟脂質(zhì)水解水平，維持脂滴穩(wěn)態(tài)，抑制脂肪酸氧化有關，但Plin5調(diào)控的脂質(zhì)代謝過程對肝細胞癌生物學行為的影響和機制仍需進一步研究。

此外，我們研究發(fā)現(xiàn)Plin5能夠降低MDA和4-HNE含量，增加SOD的活性，說明Plin5可以促進脂質(zhì)蓄積，防止脂質(zhì)過氧化，從而降低肝癌細胞的氧化應激。氧化應激水平的提高可以促進腫瘤的遷移和增殖。目前研究發(fā)現(xiàn)，H2O2可以促進血管內(nèi)皮生長因子表達，促進腫瘤的趨化和轉移[12]。ROS還可以激活ERK1/2和JNK-NF-κB通路，促進基質(zhì)金屬蛋白酶9上調(diào)，促進細胞遷移[13]。細胞中的氧化還原狀態(tài)同代謝、信號轉導及轉錄調(diào)節(jié)密切相關，細胞中持續(xù)增高的ROS水平通過代償性上調(diào)抗氧化酶類，從而促進細胞增殖。ROS能夠通過PI3K/Akt通路激活Akt，從而影響腫瘤細胞的細胞周期，促進腫瘤細胞增殖[14]。