劉丹丹 劉暢

摘要：以莠去津降解菌和硅藻土為試材制備修復(fù)菌劑，通過(guò)對(duì)菌體存活率的測(cè)定，研究菌劑對(duì)貯藏時(shí)間、溫度和紫外線的耐受能力。同時(shí)采用盆栽試驗(yàn)方法，測(cè)定菌劑對(duì)莠去津的去除效果，并比較菌劑施用前后黃瓜根部丙二醛（MDA）、過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）等氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化。結(jié)果表明，菌劑在室溫條件下存放28 d后，菌體存活率仍高達(dá)83%，對(duì)高溫和紫外線照射也表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性。盆栽試驗(yàn)中，菌劑施用28 d后，莠去津的去除率最高，接近80%。氧化應(yīng)激指標(biāo)變化表明，菌劑能夠減少黃瓜根部MDA積累，提高POD、PPO和SOD活性。不難看出，以硅藻土為載體的修復(fù)菌劑性狀良好，不僅能夠高效去除土壤中的莠去津殘留，還能減輕莠去津?qū)γ舾凶魑锏膫ψ饔谩?/p>

關(guān)鍵詞：莠去津;黃瓜;生物修復(fù);環(huán)境脅迫;PPO;SOD;POD;MDA

中圖分類(lèi)號(hào)： X592 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）22-0307-03

莠去津是在世界范圍內(nèi)都有廣泛應(yīng)用的除草劑，應(yīng)用后在環(huán)境中持久存在，且具有毒性[1]。它在環(huán)境中的高殘留常對(duì)其他作物造成毒害，帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。在治理莠去津污染的過(guò)程中，生物修復(fù)以成本低廉、操作簡(jiǎn)便、處理效果好和無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，成為眾多治理方法中的首選[3]。但生物修復(fù)方法的應(yīng)用，受環(huán)境條件限制，如溫度、光照、水分、pH值和土壤性質(zhì)等，均能影響污染修復(fù)效果[4]。選擇合適的載體材料，制成生物修復(fù)菌劑技術(shù)，不僅能夠提高菌體對(duì)不良環(huán)境條件的抗性，還能保證污染治理效果。硅藻土對(duì)環(huán)境友好，成本低，易獲得，亦是常見(jiàn)的載體材料，將其與莠去津降解菌制成修復(fù)菌劑，對(duì)莠去津的污染治理具有重要意義。

有研究表明，當(dāng)土壤中莠去津含量超過(guò)0.1 mg/kg時(shí)，將嚴(yán)重影響敏感作物的生長(zhǎng)[5]。黃瓜是常見(jiàn)的蔬菜，其種植面積大，對(duì)莠去津敏感。黃瓜抗氧化防御酶活性變化與所處環(huán)境條件密切相關(guān)，其活性的提高可以增強(qiáng)植物對(duì)逆境的耐受能力，是降低和修復(fù)逆境傷害的重要生理生化指標(biāo)[6]。了解莠去津脅迫下敏感作物的生理響應(yīng)，對(duì)于減輕植物傷害、揭示微生物修復(fù)機(jī)制都有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試藥劑 莠去津，市售商品，濃度為97%。

1.1.2 供試黃瓜 粵秀3號(hào)，市售商品。挑選大小均一的飽滿籽粒，催芽露白后播種，待植株生長(zhǎng)至2～3張復(fù)葉時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.1.3 試驗(yàn)菌株 莠去津降解菌Enterobacter sp.（腸桿菌屬），由沈陽(yáng)化工大學(xué)環(huán)境科學(xué)實(shí)驗(yàn)室篩選并保存。菌株采用無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基（每1 000 mL含K2HPO4 1.6 g、KH2PO4 0.4 g、MgSO4 0.2 g、NaCl 0.1 g、葡萄糖3 g、莠去津0.1 g）培養(yǎng)24 h，并制成生物量為2×108 CFU/mL的菌液。

1.1.4 載體材料 硅藻土，市售，粒徑為3～6 mm，呈灰白色，經(jīng)121 ℃高壓滅菌30 min，65 ℃烘干備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌劑制備及性能測(cè)定 菌劑制備：向硅藻土中噴灑 2×108 CFU/mL 菌液并混勻，用量約為60 mL菌液/100 g硅藻土，制成菌劑，并于廣口瓶中避光保存。存活率測(cè)定：28 d后，取0.1 g菌劑放入 100 mL 無(wú)菌水中，30 ℃振蕩培養(yǎng)2 h，進(jìn)行平板涂布，測(cè)定活菌數(shù)，計(jì)算菌體存活率。溫度對(duì)菌體存活的影響：在15、25、40、60 ℃條件下，將菌劑放置2、7、14、21、28 d后，振蕩培養(yǎng)，測(cè)定菌體存活率。紫外線照射對(duì)菌體存活的影響：將菌劑平鋪，放置于紫外燈下（波長(zhǎng)312 nm，功率10 W），照射0、20、40、60、80 min，振蕩培養(yǎng)后，測(cè)定菌體存活率。各試驗(yàn)均設(shè)5次重復(fù)，以游離菌為對(duì)照。菌體存活率=測(cè)得活菌數(shù)/接種細(xì)菌數(shù)×100%。

1.2.2 菌劑對(duì)土壤中莠去津的去除與黃瓜根系防御酶活性的測(cè)定 取不含莠去津的農(nóng)田表層土壤，過(guò)2 mm篩后風(fēng)干備用。土壤做3組處理，即污染土壤（莠去津10 mg/kg）、添加菌劑土壤（按土壤質(zhì)量1%向污染土壤中添加菌劑）和空白對(duì)照。將處理好的土壤裝入塑料花盆中，裝土量約200 g/盆，黃瓜4株/盆，在25 ℃培養(yǎng)箱中避光保存，保持土壤含水率在70%左右，0、7、14、28、35 d后，檢測(cè)土壤中莠去津殘留量和黃瓜根系防御酶活性。粗酶提取參考薛應(yīng)龍的方法[7]，丙二醛（MDA）含量測(cè)定采用Chen等的方法[8]，過(guò)氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用張志良等的方法[9]，多酚氧化酶（PPO）活性測(cè)定采用段春梅等的方法[10]，超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定采用Giannopolitis等的方法[11]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0和Excel 2010統(tǒng)計(jì)完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌劑制備和性能測(cè)定結(jié)果

硅藻土具有大量微孔，其比表面積大，菌體負(fù)載能力和吸水能力強(qiáng)，并能吸收和分散太陽(yáng)光，保護(hù)菌體免受不良環(huán)境條件傷害，保證菌體的有效活菌數(shù)。經(jīng)測(cè)定，在菌劑制成并存放28 d后，其菌體存活率約為80%。溫度對(duì)微生物生命活動(dòng)的影響很大，直接影響菌劑的施用效果，因此，要考察不同溫度條件下，菌劑中有效活菌數(shù)的變化情況。從菌劑制備完成至存放28 d，菌體存活率情況見(jiàn)表1。由表1可知，在較低溫度 15 ℃ 時(shí)，菌劑保存28 d后，檢測(cè)其活菌率較高，約為83%;25 ℃ 下，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，活菌率下降，28 d時(shí)為80%;在較高溫度40和60 ℃時(shí)，菌劑中活菌數(shù)量顯著降低，28 d時(shí)分別降至33%和12%。

紫外線具有殺菌能力，細(xì)菌直接暴露在陽(yáng)光下，其數(shù)量和功能都會(huì)降低，而硅藻土的特殊結(jié)構(gòu)可以吸收分散陽(yáng)光輻射，為細(xì)菌提供保護(hù)場(chǎng)所。本試驗(yàn)考察了菌劑受不同時(shí)間的紫外線照射后，菌體的存活情況。由圖1可知，在相同處理時(shí)間，菌劑中的菌體存活率均高于游離菌。紫外線照射 20 min后，菌劑中菌體存活率為92%，對(duì)照中游離菌的存活率為78%;紫外線照射80 min后，菌劑中菌體存活率為22%，對(duì)照中游離菌的存活率已下降至1.8%。不難看出，以硅藻土為載體制成的莠去津修復(fù)菌劑對(duì)紫外線的耐受力較強(qiáng)。

2.2 菌劑對(duì)土壤中莠去津的去除效果

由圖2可知，在不同修復(fù)時(shí)間，土壤中添加菌劑后莠去津殘留量一直低于不添加菌劑的污染土壤。施入菌劑28 d時(shí)，土壤中莠去津含量接近最低，約為2.0 mg/kg，去除率接近80%，而污染土壤中莠去津殘留量仍高達(dá)8.2 mg/kg。

2.3 菌劑對(duì)黃瓜根系防御酶的影響

不利的環(huán)境條件會(huì)刺激植物產(chǎn)生某些代謝反應(yīng)以降低或修復(fù)逆境帶來(lái)的傷害，黃瓜抗氧化防御酶活性的增強(qiáng)，可以提高植物的抗逆性，抗氧化防御酶系被認(rèn)為是其對(duì)環(huán)境脅迫響應(yīng)的重要指標(biāo)。在利用修復(fù)菌劑進(jìn)行土壤污染修復(fù)的過(guò)程中，檢測(cè)不同處理時(shí)間下的黃瓜根系MDA含量與POD、PPO、SOD活性。由圖3至圖6可知，在僅含莠去津的污染土壤中，MDA積累量較對(duì)照明顯增加，說(shuō)明黃瓜根系受害嚴(yán)重，添加菌劑后MDA含量有所下降。POD、PPO和SOD活性在不添加菌劑的污染土壤中最低，添加菌劑后，活性均有不同程度的升高，表明黃瓜的傷害狀況得到了一定程度的緩解。

3 討論與結(jié)論

從菌劑制備及其性能測(cè)定結(jié)果可以看出，以硅藻土為載體制備的修復(fù)菌劑，在耐貯藏、高溫和紫外線等方面，性能良好，對(duì)土壤中的莠去津殘留有較好的修復(fù)效果。

MDA是膜脂過(guò)氧化過(guò)程中形成的產(chǎn)物，其含量能夠很好地反映細(xì)胞膜損傷程度[12]。POD是植物中廣泛存在的酶，是反映根系活力的重要指標(biāo)。PPO的作用是進(jìn)行去甲基化反應(yīng)，與生長(zhǎng)素（IAA）含量和植物根系生長(zhǎng)有關(guān)[13]。SOD在清除體內(nèi)活性氧方面有重要作用，可避免植物的傷害作用[14]。對(duì)比菌劑施用前后黃瓜根系氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化情況可知，在菌劑處理土壤中，MDA含量降低，POD、PPO和SOD活性都有明顯升高，表明莠去津?qū)S瓜的傷害作用得到了緩解。

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