趙圓圓 許晨新 張杰

摘要：基于粉末與橫切面顯微方法鑒別中藥材威靈仙的3種基原，完善威靈仙藥材的顯微鑒別方法。對市場上采購的14批威靈仙藥材分別采用橫切面和粉末制片，考察并優(yōu)化制片方法，觀察比較不同批次藥材的顯微特征。結(jié)果表明，橫切面的外皮層細胞排布、韌皮部、木質(zhì)部顯微特征顯著，粉末的木纖維、韌皮纖維、石細胞、導管、非腺毛、木栓細胞、表皮細胞、皮層細胞顯微特征顯著。結(jié)合《中華人民共和國藥典》標準，可根據(jù)橫切面的外皮層細胞延長方向鑒別威靈仙;根據(jù)粉末的石細胞和韌皮纖維特征鑒別棉團鐵線蓮和東北鐵線蓮。采購的14批威靈仙藥材中3批為威靈仙，2批為棉團鐵線蓮，9批為東北鐵線蓮。說明粉末顯微可有效彌補橫切面顯微鑒別的不足。將粉末與橫切面顯微相結(jié)合，可快速高效地鑒別中藥材威靈仙的3種基原，操作簡單，顯微特征明顯，判別直觀準確，具有很高的專屬性和耐用性，對《中華人民共和國藥典》現(xiàn)有顯微鑒別方法是一個有力的補充。

關(guān)鍵詞：威靈仙;基原鑒別;橫切面顯微;粉末顯微

中圖分類號： R282.5 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0234-04

中藥材威靈仙按2015年版《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《藥典》）規(guī)定有3種基原，分別為毛茛科植物威靈仙（Clematis chinensis Osbeck）、棉團鐵線蓮（Clematis hexapetala Pall.）、東北鐵線蓮（Clematis manshurica Rupr.）的干燥根和根莖，臨床上主要用于治療風濕痹痛、肢體麻木、筋脈拘攣、屈伸不利[1-2]。一直以來，市場上銷售的威靈仙都只有產(chǎn)地信息，缺乏基原標志。尤其是近年來對威靈仙的需求量逐漸增加，使得威靈仙藥材的基原問題更顯凸出[3]，給臨床應用帶來了諸多的問題[4-5]?，F(xiàn)有威靈仙鑒別的研究報道很多，包括性狀[6]、高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜[7]、紫外光譜[8]、傅里葉變換紅外光譜[9]、DNA分子鑒定技術(shù)[10-11]、薄層色譜[12]等多種技術(shù)手段，但均用于鑒別威靈仙及其鐵線蓮屬偽品。中藥材威靈仙3種基原的鑒別主要是依據(jù)2015年版《藥典》收載的性狀特征和橫切面顯微方法。但市場上的威靈仙多為切段藥材，性狀特征已經(jīng)被破壞，而顯微鑒別中的纖維束、石細胞等特征均為典型的粉末特征，采用橫切面顯微方法觀察時，特征不明顯，判別難度大，棉團鐵線蓮和東北鐵線蓮的區(qū)分難度大，方法的專屬性和耐用性均有待進一步提高。有學者采用近紅外光譜[13]區(qū)分威靈仙和東北鐵線蓮，但近紅外儀器價格昂貴，且仍舊無法解決3種基原的鑒別問題，尤其是棉團鐵線蓮和東北鐵線蓮的鑒別。本研究將在威靈仙現(xiàn)有的《藥典》方法基礎上，采用粉末顯微和橫切面顯微相結(jié)合，以期建立1種簡單快捷、特征直觀的顯微鑒別方法，進一步完善《藥典》方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

FA2004型電子天平（上海圖新電子科技有限公司）;BM2000生物數(shù)碼顯微圖像分析系統(tǒng)（合肥諾瑞科學儀器有限公司）;歌能G-100S型超聲波清洗儀（深圳市歌能清洗設備有限公司）;JP-100A-2高速多功能粉碎機（上海市久品工貿(mào)有限公司）;40、60、80、100、125目標準檢驗篩（浙江省上虞市道墟張興紗篩廠）;25.4×76.2 mm載/蓋玻片（武漢致誠信達科技開發(fā)有限公司）;TS-DI10-L/H型實驗室超純水機（陶氏水處理設備工程有限公司）。

威靈仙藥材購于安徽亳州藥材市場和淮安市各大藥房，共計8個產(chǎn)地，14個批次，具體信息見表1。各藥材樣品均保存于江蘇省特色資源開發(fā)與藥用重點實驗室。無水乙醇（色譜純，天津基準化學試劑有限公司）;氫氟酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）;藏紅T（生物染色劑，國藥集團化學試劑有限公司）;固綠FCF（生物染色劑，上海沃凱生物技術(shù)有限公司）;鹽酸（分析純，南京奧佳化工有限公司）;二甲苯（分析純，上海沃凱生物技術(shù)有限公司）;中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司）;水合氯醛（分析純，上海展云化工有限公司）。水為筆者所在實驗室自制超純水。

1.2 試驗方法

1.2.1 橫切面切片 分別取14批威靈仙藥材，選取根部大小適中者用15%氫氟酸進行軟化24 h，用流水沖洗至中性，切成薄片，放至盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中;挑選切面完整透明且薄厚均勻的切片放入50%乙醇溶液中脫水5 min，用番紅染液染色30 min， 移入50%乙醇脫色5 min， 進而轉(zhuǎn)入含1.0～1.5 mmol/L鹽酸的70%乙醇中脫色2～3 h;用固綠染液染色1～2 s，再用95%乙醇溶液沖洗掉多余染液，放入無水乙醇中脫色5 min;在二甲苯和無水乙醇溶液（體積比1 ∶ 1）中透化 5 min，在二甲苯中透化5 min，用中性樹膠制片，并在顯微鏡下觀察、拍照并保存圖像。

1.2.2 橫切面切片條件考察

1.2.2.1 番紅染液染色時間 本研究分別考察番紅染液染色時間對切片染色效果的影響，結(jié)果見表2。由此看出，番紅染色的最佳時間為30 min，此條件下染色完成后的切片不同部位顏色區(qū)別明顯，易觀察。

1.2.2.2 固綠染液染色時間 本研究考察固綠染液染色時間對切片染色效果的影響，結(jié)果見表3。由此看出，固綠染液染色的最佳時間為1～2 s，此條件下染色完成后的切片不同部位顏色區(qū)別明顯，易觀察。

1.2.2.3 番紅染液脫色條件 本研究考察了番紅染液脫色時，70%乙醇中的鹽酸濃度及脫色時間對切片脫色效果的影響。切片經(jīng)50%乙醇脫色5 min后，再分別用含有不同濃度鹽酸的70%乙醇脫色一定時間，觀察脫色效果。由表4可知，切片脫色時的70%乙醇中鹽酸濃度為1.0～1.5 mmol/L較適宜。

2 結(jié)果與分析

2.1 橫切面切片顯微特征分析