劉彥泓 劉岑杰

摘?要：

轉基因農作物的商品化滿足了人民日益增長的物質需求，但轉基因作物在食用安全性、對生態(tài)環(huán)境的影響等方面一直備受關注。本研究采用實時熒光PCR方法檢測飼料及飼料原料中轉基因大豆GTS40-3-2成分，可以準確、快速完成檢測，滿足飼料中轉基因成分的監(jiān)管需求。實驗表明目前飼料中轉基因大豆GTS40-3-2成分的占有率較高，應引起相關部門的重視，加大監(jiān)管力度。

關鍵詞：

飼料;轉基因大豆GTS40-3-2;實時熒光PCR

中圖分類號：S-3

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20191230008

19世紀80年代興起的DNA重組技術得到了迅猛的發(fā)展和廣泛的應用。據統(tǒng)計表明：從1996年生物技術即轉基因作物商業(yè)化第1年以來到2018年底，全球轉基因作物的種植面積增長了約113倍，目前已經累計達到25億hm2。經統(tǒng)計顯示2018年有26個國家種植了約1.917億hm2轉基因作物，全世界有70個國家或地區(qū)應用了轉基因作物。我國是轉基因作物種植大國，2018年轉基因作物種植面積為290萬hm2，居世界第8位[1]。我國除了是轉基因作物的種植大國，也是轉基因農產品的進口大國。轉基因產品除了可能存在潛在的環(huán)境污染、生態(tài)風險，也可能對人類健康和自然環(huán)境帶來不利影響[2]。對轉基因產品的安全性，特別是轉基因食品對人和動物的健康以及對生態(tài)環(huán)境的影響，自轉基因技術出現以來，就是世界各國及聯(lián)合國等國際組織關心的焦點問題。因此轉基因產品的使用安全性問題一直是人們關心的問題，2002年歐盟要求對轉基因產品從生產、運輸、保存、銷售等過程進行全程的跟蹤和檢測[3]。目前已有幾十個國家和地區(qū)對轉基因產品采取強制性的標志管理制度。我國2002年3月20日起施行的《農業(yè)轉基因生物標識管理辦法》規(guī)定：轉基因農產品的直接加工品，標注為“轉基因××加工品（制成品）”或者“加工原料為轉基因××”。因此開展轉基因產品檢測，建立完善的檢測方法，對滿足轉基因生物安全監(jiān)管要求、保證轉基因生物標識管理制度方面有重大意義。

目前國內外轉基因產品檢驗方法主要有2種：核酸水平的檢測和蛋白水平的檢測[4]。核酸檢測技術主要包括普通定性PCR檢測技術、實時熒光PCR檢測技術、數字PCR檢測技術、等溫擴增檢測技術、基因芯片檢測技術以及二代測序檢測技術等;蛋白檢測技術主要包括SDS聚丙烯凝膠電泳分析檢測技術、酶聯(lián)免疫分析檢測技術等[5]。另外，還有紅外光譜技術鑒別檢測方法等其他方法[6]。

本研究采用實時熒光PCR方法，檢測飼料中轉基因大豆GTS40-3-2成分，針對pCaMV35S、tNOS、GTS40-3-2品系特異基因進行檢測，選擇市場上市售的不同種類的飼料樣品進行檢測，表明完全可以滿足日常檢測需求，為飼料產品中轉基因大豆成分檢測提供檢測技術支持。

1?材料

1.1?原料及試驗樣品

所有原料和市售飼料樣品購自農村小型商店、寵物市場以及超市。原料為4種豆粕;市售飼料樣品4種，包括肉牛專用復合預混料、中豬預混料、產蛋雞飼料、通用型狗糧。轉基因大豆GTS40-3-2豆粉標準品為本實驗室保存。

1.2?主要試劑

樣本DNA提取采用試劑盒：Magnetic DNA Purification System For Food（Promega公司產品）;實時熒光PCR反應試劑：Premix Ex TaqTM （Probe qPCR）（Takara Bio公司產品）。

1.3?引物及探針序列

引物及探針合成、標記均為Takara Bio公司產品，引物及探針序列見表1。

1.4?主要儀器

低溫高速離心機（型號：5427R ），Eppendorf（艾本德中國有限公司）產品;實時熒光PCR儀（型號：QuantStudio 7Flex），Thermo Fisher Scientific Thermo Fisher Scientific（賽默飛世爾科技有限公司）產品。

2?方法

2.1?模板DNA的提取

將樣品分別研磨成粉后采用Promega公司Magnetic DNA Purification System For Food試劑盒提取，提取的過程注意防止交叉污染。

2.2?實時熒光PCR檢測

反應體系見表2。

擴增條件95℃ 10min;95℃ 1min，60℃ 30s（讀取熒光），40個循環(huán)。

2.3?實驗設置

每個實時熒光PCR反應均需要設置2個平行實驗，同時還應設置陽性對照、陰性對照和空白對照。陽性對照：實時熒光PCR反應體系中使用轉基因大豆GTS40-3-2提取的DNA為模板;陰性對照：實時熒光PCR反應體系中采用已知不含轉基因大豆GTS40-3-2的大豆DNA為模板;空白對照：實時熒光PCR反應體系中使用無菌雙蒸水代替DNA模板。

3?結果及分析

根據擴增結果，內源基因Lectin和外源基因pCaMV35S 、tNOS 、GTS40-3-2檢測結果均為陽性，空白對照、陽性對照和陰性對照均符合要求，判定該樣品含轉基因大豆GTS40-3-2成分。擴增圖見圖1至圖4。（結果為單次實驗結果，平行實驗結果相同）。

樣品1～8分別為：1號豆粕、2號豆粕、3號豆粕、4號豆粕、肉牛專用復合預混料、中豬預混料、產蛋雞飼料、通用型狗糧）。檢驗結果表明：僅8號樣品未檢出轉基因大豆GTS40-3-2成分，其余7個樣品均含有大豆GTS40-3-2成分。

4?結論與討論

目前對于轉基因大豆成分的檢測，最常采用的檢測方法就是PCR檢測方法，而實時熒光PCR檢測的優(yōu)勢有很多：如靈敏度高、操作方便、檢測時間短等[4]。目前，實時熒光PCR TaqMan探針技術在植物基因鑒定、水產漁業(yè)等方面已經得到了很普遍的應用[8]。對8份市售飼料原料及產品進行檢測，檢測結果表明：4份豆粕中均檢出轉基因大豆GTS40-3-2成分，4份飼料中僅通用型狗糧未檢出轉基因大豆GTS40-3-2成分，其它3種飼料均含有轉基因大豆GTS40-3-2成分。本研究表明實時熒光PCR方法完全可以滿足飼料中轉基因大豆GTS40-3-2成分檢測要求，可以用來快速、準確地開展日常檢測工作。本研究在實驗過程中也發(fā)現飼料多經過高溫蒸煮、烘烤等生產工藝，因此提取的DNA模板的DNA濃度和純度不高，模板的濃度和純度對目的基因的檢測來說是較為重要的。建議在實驗過程中，利用紫外分光光度計測定模板DNA的濃度，并計算出A260 nm/A280 nm的比值，通常情況下，比值在1.7～2.0之間比較好。同時，在模板DNA質量滿意的情況下，建議實時熒光PCR反應體系中模板的添加量為50～100 ng。日常檢測數據顯示飼料中使用轉基因產品的比例很高，而我國對飼料及飼料原料中轉基因成分的使用管理力度不大，建議相關部門加強對轉基因產品的使用進行監(jiān)管，保證含有轉基因產品的飼料合理、合法使用。

參考文獻

[1] 2018年全球生物技術/轉基因作物商業(yè)化發(fā)展態(tài)勢[J].中國生物工程雜志，2019，39（08）：1-6.

[2]王南，李海燕.轉基因大豆概況及其安全性[J].吉林農業(yè)，2016（19）：118.

[3]方獻平，馬華升，余紅，金亮，劉輝，張樂，翁麗萍，來文國.轉基因常見檢測技術與蛋白質組學的應用[J].浙江農業(yè)科學，2013（10）：1328-1330.

[4]孟靜，任易婕，孫瀟慧，鐘麗霞，霍勝楠.聚合酶鏈式反應方法檢測豆制品中轉基因成分的研究概述[J].中國釀造，2018，37（11）：22-25.

[5]石盼盼，王璐，郝麗花，謝文佳，等.大豆及其加工食品轉基因成分檢測技術研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2019，10（10）：3166-3172.

[6]方慧，張昭，王海龍，楊向東，何勇，鮑一丹.基于中紅外光譜技術鑒別轉基因大豆的方法研究[J].光譜學與光譜分析，2017，37（03）：760-765.

[7]國家市場監(jiān)督管理總局、中國國家標準化管理委員會. GB/T19495.4-2018 轉基因產品檢測 實時熒光定性聚合酶鏈式反應（PCR）檢測方法[S].中國標準出版社，2018.

[8]姜文燦，岳素文，江洪，等.TaqMan探針法實時熒光定量PCR的應用和研究進展[J].臨床檢驗雜志（電子版），2015，4（01）：797-805.

作者簡介：

劉彥泓（1976-），女，碩士，高級工程師。研究方向：分子生物學及微生物學檢驗。