張忠勝 劉雙鳳 黃四春

清遠(yuǎn)市人民醫(yī)院∕廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第六醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（廣東清遠(yuǎn)511518）

急性腦梗死約占所有腦卒中類型的80%，具有高發(fā)病率、高致殘率和高致死率的特點(diǎn)。腦缺血發(fā)生后，腦組織氧化損傷及神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加。胸腺素β4（thymosin β4，Tβ4）是由43 個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，具有促進(jìn)干細(xì)胞分化，增強(qiáng)細(xì)胞增殖、遷移，抗凋亡，促進(jìn)血管生成等多種生物學(xué)功能，與組織再生、血管生成和創(chuàng)傷愈合密切相關(guān)［1-3］。多個(gè)研究提示Tβ4 具有神經(jīng)保護(hù)作用，能增加脊髓損傷大鼠神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，降低促炎細(xì)胞因子基因表達(dá)［4］，改善腦缺血大鼠的神經(jīng)損傷癥狀［5］，有效抑制體外氧糖剝奪∕復(fù)糖復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡和自噬［6］。而Tβ4 對局灶性缺血再灌注損傷SD 大鼠的氧化損傷和神經(jīng)元凋亡作用仍不清楚。本研究采用改良線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞缺血再灌注模型，應(yīng)用腹腔注射Tβ4，探討Tβ4 對腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 Tβ4 重組蛋白購自CLOUDCLONE CORP（USA）。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNNEL）凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物公司（中國）。2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）Stain kit、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器 倒置顯微鏡（XDZ-103CED），上海領(lǐng)成生物科技有限公司產(chǎn)品；L6 紫外分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DNM-9602G 酶標(biāo)儀分析儀，北京普朗新技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性SD 大鼠（體質(zhì)量250～300 g，7～8 周齡）購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（滬）20130016。

1.2 研究方法

1.2.1 動(dòng)物分組與建模 所有SD 大鼠均于室溫下正常喂養(yǎng)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將48 只SD 大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（Sham組）、缺血再灌注組（I∕R組）和Tβ4 干預(yù)組（Tβ4組），每組16 只。Sham組大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈僅被隔離，不栓塞大腦中動(dòng)脈，然后縫合切口。模型制備參考改良Zea-Longa 線栓法［7］，I∕R組和Tβ4組大鼠予尼龍線栓塞大腦中動(dòng)脈2 h 后復(fù)通。Tβ4組大鼠在大腦中動(dòng)脈阻塞前后各1 h 分別腹腔注射Tβ4（8 μg∕kg）［8］，Sham組和I∕R組大鼠腹腔注射等量生理鹽水。

1.2.2 Longa 評分法進(jìn)行神經(jīng)功能評分［7］各組大鼠均在腦缺血再灌注24 h 后進(jìn)行神經(jīng)功能評分。0 分：沒有神經(jīng)損傷的癥狀；1 分：不能完全伸展對側(cè)前爪；2 分：大鼠向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3 分：向?qū)?cè)傾倒；4 分：不能自行行走，失去意識(shí)。分?jǐn)?shù)越高表明神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。只有評分在1～3 分的大鼠被納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 TTC 染色法測定各組大鼠腦梗死體積 將實(shí)驗(yàn)大鼠斷頭取腦并用鹽水洗滌腦組織，然后將腦組織在-20 ℃冷凍20 min，收集2 mm 厚度的腦組織冠狀切片，并立即將切片在含有2%TTC 的PBS緩沖液中培養(yǎng)，37 ℃避光孵育30 min，隨后在4%甲醛溶液中固定24 h。取出固定好的腦片，將標(biāo)本按組排列拍照，腦片中白色部分為梗死腦組織，采用Image-proplus 6.0 軟件測量并計(jì)算腦切片梗死體積及與總體積的百分比。

1.2.4 TUNEL 法檢測缺血區(qū)神經(jīng)元凋亡情況 按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，石蠟切片脫蠟、烘片、乙醇水合，二氨基聯(lián)苯胺鏡下顯色、水洗、蘇木素復(fù)染。甘油封片后熒光顯微鏡下觀察，從每個(gè)切片的缺血半暗帶區(qū)域中隨機(jī)選取5 個(gè)視野，采用圖像分析軟件計(jì)算相應(yīng)區(qū)域TUNEL 陽性細(xì)胞。正常細(xì)胞核為藍(lán)色熒光，凋亡細(xì)胞核為綠色熒光。計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)∕總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.5 化學(xué)比色法檢測MDA 含量和SOD、GSHPx 活性 于缺血2 h 再灌注24 h 后處死大鼠，斷頭，取出缺血再灌注側(cè)腦組織，沖洗干凈后稱重。用生理鹽水預(yù)冷，制備腦組織勻漿液（10%），離心（4 000 r∕min，10 min）后取上清，采用化學(xué)比色法檢測腦組織MDA 含量和GSH-Px、SOD 活性，相關(guān)具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用x±s表示，多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺血2 h 再灌注24 h 后各組大鼠神經(jīng)功能評分比較 造模前3組大鼠Longa 評分均為0，表明3組大鼠基線相同。缺血2 h 再灌注24 h 后，I∕R組Longa評分顯著高于Sham組（表1），說明大鼠局灶性腦缺血再灌注模型構(gòu)建成功。與I∕R組相比，Tβ4組Long 評分顯著降低（表1）。

表1 大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能評分、腦梗死體積及細(xì)胞凋亡指數(shù)比較Tab.1 Comparison of neurological function score，cerebral infarction volume and apoptotic index in different groups x±s

2.2 大鼠腦缺血再灌注后腦梗死體積變化 腦缺血2 h 再灌注24 h 后，對各組大鼠腦組織進(jìn)行TTC染色。在Sham組中，腦切片全部是紅色的，沒有觀察到梗死區(qū)。然而，I∕R組和Tβ4組存在一些白色梗死區(qū)域，與動(dòng)脈栓塞范圍一致。結(jié)果顯示，與Sham組相比，I∕R組和Tβ4組腦梗死體積顯著增加，Tβ4組腦梗死體積顯著小于I∕R組（表1、圖1）。

圖1 Tβ4 對SD 大鼠腦梗死體積的影響Fig.1 The effects of thymosin β4 on cerebral infarction volume in SD rats

2.3 大鼠腦梗死周邊區(qū)細(xì)胞凋亡指數(shù)比較TUNNEL 法檢測凋亡結(jié)果顯示，I∕R組凋亡率顯著高于Sham組。與I∕R組比較，Tβ4組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著降低（表1）。

2.4 各組大鼠腦組織SOD、GSH-Px 活性和MDA含量比較 與Sham組比較，I∕R組腦組織中SOD和GSH-Px 活性顯著降低，而MDA 含量顯著升高；與I∕R組 比 較，Tβ4組SOD 和GSH-Px 活性升高，MDA 含量降低（表2）。

表2 大鼠腦缺血再灌注后SOD、GSH-Px 活性和MDA 含量變化Tab.2 SOD，GSH-Pxactivity and MDA content after cerebral ischemia-reperfusion in rats ±s

表2 大鼠腦缺血再灌注后SOD、GSH-Px 活性和MDA 含量變化Tab.2 SOD，GSH-Pxactivity and MDA content after cerebral ischemia-reperfusion in rats ±s

注：與Sham組比較，#P＜0.05；與I∕R組比較，*P＜0.05

組別Sham組I∕R組Tβ4組SOD（U∕mgprot）116.82±12.62 75.20±11.71#94.97±10.31#*GSH-Px（U∕mgprot）73.54±8.77 40.17±7.15#61.15±10.31#*MDA（nmol∕mgprot）6.92±0.74 12.15±1.75#8.17±0.91#*

3 討論

氧化損傷被認(rèn)為是腦缺血∕再灌注損傷的重要因素之一［9-12］，腦缺血再灌注損傷后，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)的平衡被破壞，機(jī)體產(chǎn)生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），ROS 引起膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生病理性損傷。MDA、GSH-Px 和SOD 與氧自由基密切相關(guān)［13-15］，SOD 和GSH-Px 是體內(nèi)對抗ROS 過多產(chǎn)生的兩種主要抗氧化酶，能清除氧自由基，起到保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷的作用，二者活力的高低能夠反應(yīng)機(jī)體清除氧自由基能力和抗氧化能力。MDA 為脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量與氧自由基含量呈正相關(guān)，可以反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平及受氧化應(yīng)激損害的程度。

如前所述，Tβ4 是一種由43 個(gè)氨基酸殘基組成的小分子多肽，在機(jī)體廣泛分布，近年來多位學(xué)者報(bào)道了其神經(jīng)保護(hù)作用，可作為神經(jīng)損傷和神經(jīng)退行性疾病的修復(fù)∕再生療法［16］，改善3 個(gè)月齡大鼠栓塞性卒中模型的神經(jīng)功能［17］，可促進(jìn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病中的少突膠質(zhì)細(xì)胞生成［18］。MORRIS 等［19-20］的研究發(fā)現(xiàn)，Tβ4 治療可以減少老年雄性Wistar 大鼠腦梗死體積，改善大腦中動(dòng)脈栓塞后卒中大鼠的神經(jīng)功能。本研究發(fā)現(xiàn)，Tβ4干預(yù)可減少腦梗死體積9%左右，改善大腦中動(dòng)脈栓塞后SD 大鼠的神經(jīng)功能，與MORRIS 等［19-20］的報(bào)道一致。為了進(jìn)一步分析Tβ4 改善神經(jīng)功能的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了與氧化損傷相關(guān)的SOD、GSH-Px 和MDA 含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tβ4 處理顯著降低了MDA 含量，顯著上調(diào)了GSH-Px 和SOD 的活性，提示減輕氧化損傷，清除氧自由基可能是Tβ4抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡和改善神經(jīng)功能的重要機(jī)制。綜上所述，Tβ4 可能通過降低MDA 含量，提高SOD、GSH-Px 的活性，清除氧自由基、減輕氧化損傷來抑制細(xì)胞凋亡、提高組織抗氧化能力，從而減少腦梗死體積，改善神經(jīng)功能。

本研究結(jié)果提示，Tβ4 具有治療腦缺血的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，本研究僅在動(dòng)物模型水平進(jìn)行了探討，這也是本研究也有不足之處，下一步將在細(xì)胞模型水平進(jìn)一步深入研究。