梅清 李小鵬 吳振平 李丹 張文苑 余婷婷 張倫理

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科（南昌330006）

據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道全球約20 億人曾感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），其中2.4 億人為慢性HBV 感染者。每年約有100 萬人死于HBV感染所致的肝功能衰竭、肝硬化和肝細(xì)胞癌［1］。慢性HBV 感染成為亟待解決的全球公共衛(wèi)生問題。目前由于尚未完全闡明慢性HBV 感染形成的機(jī)制，所以很難實(shí)現(xiàn)HBV 的免疫清除。既往研究表明HBV 感染時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)激活，并產(chǎn)生一系列免疫效應(yīng)，包括免疫細(xì)胞數(shù)改變、免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子的濃度變化如：干擾素-γ（interferonγ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），免疫細(xì)胞的細(xì)胞表面受體的陽性率發(fā)生改變：如程序性死亡受體-1（programmed death receptor-1，PD-1），而這些物質(zhì)的含量皆與HBV 感染后的預(yù)后相關(guān)。外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）是由T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞組成的混合群體，在先天性免疫、適應(yīng)性免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［2］。近些年有大量文獻(xiàn)［3-5］報(bào)道HBV 能感染PBMCs，其臨床價(jià)值也正越來越引起重視。體外觀察PBMCs 感染HBV 后出現(xiàn)的一系列免疫效應(yīng)變化，有益于理解HBV 感染在體內(nèi)發(fā)生的機(jī)制，為進(jìn)一步理解慢性HBV 感染形成的機(jī)制提供幫助。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑 （1）細(xì)胞：PBMC 取自10 名健康志愿者的外周靜脈血（健康志愿者為近期體檢排除乙肝、丙肝、艾滋、腫瘤等疾病且乙肝五項(xiàng)全陰的志愿者）。（2）主要試劑：RPMI 1640 培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Hyclone 公司、胎牛血清購(gòu)于德國(guó)PAN 公司；人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)于天津TBD 公司；重組人白細(xì)胞介素2（interleukin 2，IL-2）購(gòu)于美國(guó)Proteintech 公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（cell counting kit，CCK8）購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司；IFN-γ ELISA 和TNF-α ELISA 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于武漢三鷹生物工程有限公司；使用的所有流式抗體均為北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司的Biolegend（USA）抗體，包括鼠抗人CD3-FITC、CD8-PE∕CY7、PD-1-PE 抗體和抗鼠IgGl-FITC、IgGl-PE∕CY7、IgGl-PE 同型對(duì)照抗體。

1.2 方法

1.2.1 提取和培養(yǎng)人PBMCs 取健康人外周靜脈血80 mL，采用Ficoll 法分離PBMC，并用完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、IL-2 200 U∕mL）調(diào)節(jié)PBMC細(xì)胞濃度至1.0×106個(gè)∕mL，接種于6 孔板中，每孔2 mL。

1.2.2 HBV 持續(xù)刺激PBMCs 在門診收集HBV DNA 濃度為2×107IU∕mL 的免疫耐受期的HBV 感染者血清。實(shí)驗(yàn)分兩組，分別為對(duì)照組（PBMCs）、實(shí)驗(yàn)組（免疫耐受期的HBV感染者血清+PBMCs），每組設(shè)置重復(fù)孔4 孔。輕混培養(yǎng)液使其均勻后置入CO2孵箱中培養(yǎng)，前6 d 每隔1 d 對(duì)對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組補(bǔ)充500 μL 的完全培養(yǎng)基，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組還每隔1 d 每孔補(bǔ)充25 μL 的慢性HBV 感染者的血清，在第8 天時(shí)進(jìn)行離心換液，以后每隔1 d 進(jìn)行1 次換液，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組每隔1 d 還需補(bǔ)充25 μL 患者血清，收集第0、2、4、6、8、12、18、24 天的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的上清液。

1.2.3 CCK-8 檢測(cè)PBMC 增殖 參照說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在0、2、4、6、8 d 時(shí)，將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組PBMC，重懸，取其中的100 μL 細(xì)胞懸液和空白組（完全培養(yǎng)基）100 μL 分別接種于96 孔板中，實(shí)驗(yàn)中每組均設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，結(jié)果以3 孔平均值計(jì)算。向每孔加入100 μL CCK-8 試劑，然后置入37 ℃CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)時(shí)的吸光度。

1.2.4 ELISA 法檢測(cè)IFN-γ和TNF-α的濃度 采用ELISA 法檢測(cè)收集的（第0、2、4、6、8、12、18、24天）實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ和TNF-α的濃度，參照說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)酶標(biāo)儀測(cè)定出的標(biāo)準(zhǔn)品的OD值繪畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，繼而再計(jì)算出IFN-γ和TNF-α的濃度。

1.2.5 流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)CD8+T 細(xì)胞上PD-1 陽性率 提取并收集未開始刺激時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的PBMC，以及HBV 刺激24 d 時(shí)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的PBMC，離心后，用PBS 洗滌，并再次用PBS 調(diào)整細(xì)胞懸液至100 μL，加入鼠抗人CD3-FITC、CD8-PE∕CY7 及PD-1-PE 抗體，于4 ℃避光溫育30 min，用PBS 洗滌2 次后在貝克曼FC500 流式儀上機(jī)，使用對(duì)應(yīng)的同型對(duì)照組和裸細(xì)胞組進(jìn)行對(duì)照。用CD3+CD8+雙陽性細(xì)胞群設(shè)門，標(biāo)出CD3+CD8+PD-1+全陽性的百分比。數(shù)據(jù)使用CXP軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間單變量比較使用獨(dú)立t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。當(dāng)P＜0.05 時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線 在培養(yǎng)的0、2、4、6、8 d 分別用CCK-8 試劑盒檢測(cè)PBMC 的增殖狀況。CCK8法檢測(cè)結(jié)果顯示經(jīng)過患者血清刺激的PBMC 在前8 d 隨著時(shí)間的增加，數(shù)量逐漸增加，且在第8 天時(shí)實(shí)驗(yàn)組數(shù)量明顯高于對(duì)照組（P＜0.05，圖1）。

圖1 PBMC 培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of PBMC culture

2.2 上清液炎癥因子的檢測(cè) 未開始刺激（即HBV 刺激的第0 天）時(shí)，IFN-γ 和TNF-α 分泌水平均低于檢測(cè)值下限。在刺激的第8天實(shí)驗(yàn)組TNF-α濃 度（1 646.89±149.92）pg∕mL 高于對(duì)照組［（1 061.20±151.29）pg∕mL，t= 4.76，P= 0.009，圖2］。刺激的第24 天時(shí)，實(shí)驗(yàn)組TNF-α 濃度（395.67 ±25.17）pg∕mL 低于對(duì)照組［（576.33±15.18）pg∕mL，t=-10.65，P= 0.000，圖2］。在刺激的第8 天，實(shí)驗(yàn)組IFN-γ 的濃度（134.00±15.10）pg∕mL 高于對(duì)照組［（24.26±8.22）pg∕mL，t= 11.06，P= 0.000，圖3］。在刺激的第24 天，實(shí)驗(yàn)組IFN-γ 的濃度（14.05± 1.65）pg∕mL 低于對(duì)照組［（20.75±2.47）pg∕mL，t=-3.91，P=0.017，圖3］。

圖2 各組隨著培養(yǎng)天數(shù)的改變上清液中TNF-α 的濃度Fig.2 The concentration of TNF-α in the supernatant of each group changed with the number of culture days

圖3 各組隨著培養(yǎng)天數(shù)的改變上清液中IFN-γ 的濃度Fig.3 The concentration of IFN-γ in the supernatant of each group changed with the number of culture days

2.3 CD8+T 細(xì)胞上PD-1 的陽性率 未開始刺激時(shí)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組CD8+T 細(xì)胞上PD-1 陽性率均為（12.23±1.72）%，病毒持續(xù)刺激24 d 后，實(shí)驗(yàn)組PD-1 表達(dá)水平與對(duì)照組PD-1 表達(dá)水平分別為（16.70±1.65）%、（13.17±2.31）%。實(shí)驗(yàn)組刺激24 d后（圖4、5）與未開始刺激時(shí)（圖6、7）相比，PD-1 表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.032）；對(duì)照組PD-1 表達(dá)水平第24 天（圖8、9）與未開始刺激時(shí)（圖6、7）相比（P=0.605），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

全球約有1∕3 的人口都感染過HBV，但不同時(shí)期感染出現(xiàn)的結(jié)局很可能會(huì)不同。嬰幼兒期感染HBV 易發(fā)展為慢性肝炎，而成年期感染的則只有不到5%的為慢性乙型肝炎，大多數(shù)為急性肝炎。目前，HBV 感染慢性化的具體機(jī)制仍尚未闡明［6］，慢性乙型肝炎也因此無法實(shí)現(xiàn)根治。既往研究［7-8］指出HBV 感染的發(fā)病機(jī)制主要是免疫介導(dǎo)的，所以相關(guān)的免疫效應(yīng)的研究將可能有利于開辟治療乙肝的新途徑。本次實(shí)驗(yàn)通過在體外用免疫耐受期HBV 感染者血清刺激健康人PBMCs 后發(fā)現(xiàn)，PBMCs 細(xì)胞群在受到HBV 刺激后初期部分免疫細(xì)胞能增殖，并且產(chǎn)生炎癥因子IFN-γ和TNF-α。但長(zhǎng)期刺激后其炎癥因子產(chǎn)生能力減弱，且CD8+T細(xì)胞表面抑制性受體PD-1 表達(dá)上調(diào)。

圖4 刺激24 d 時(shí)的實(shí)驗(yàn)組CD3+CD8+細(xì)胞群Fig.4 The cell population of CD3+ CD8+ in the experimental group at 24 days of stimulation

圖5 刺激24 d 時(shí)的實(shí)驗(yàn)組CD8+T 細(xì)胞上PD-1 陽性率Fig.5 The positive rate of PD-1 on CD8+ T cells in the experimental group stimulated at 24 days of stimulation

圖6未開始刺激時(shí)CD3+CD8+細(xì)胞群Fig.6 The cell population of CD3+ CD8+ without stimulation

圖7 未開始刺激時(shí)CD8+ T 細(xì)胞上PD-1 陽性率Fig.7 The positive rate of PD-1 on CD8+ T cells without stimulation

圖8 第24天時(shí)的對(duì)照組CD3+ CD8+細(xì)胞群Fig.8 The cell population of CD3+ CD8+ in the control group on day 24

圖9 第24天時(shí)的對(duì)照組CD8+T 細(xì)胞上PD-1 陽性率Fig.9 The positive rate of PD-1 on CD8+T cells in the control group on day 24

HBV 感染引起的應(yīng)答是由PBMCs 中多種免疫細(xì)胞和分泌的相關(guān)細(xì)胞因子共同參與。當(dāng)HBV 感染時(shí)，乙型肝炎病毒核心抗原、乙型肝炎表面抗原、乙型肝炎病毒e 抗原皆能激活免疫系統(tǒng)［4-5］，繼而免疫細(xì)胞增殖，并大量分泌IFN-γ 和TNF-α。IFN-γ和TNF-α這兩種細(xì)胞因子能增強(qiáng)PBMCs 中多種免疫活性細(xì)胞的功能，包括抗原的識(shí)別、呈遞和吞噬等功能。既往研究［9-10］還指出形成特異性免疫的時(shí)間是1～2 周。本次實(shí)驗(yàn)用免疫耐受期的HBV 感染者血清刺激PBMCs 時(shí)，在第8 天時(shí)PBMC大量增殖，實(shí)驗(yàn)組IFN-γ和TNF-α均明顯高于正常組。這說明在8 d 時(shí)免疫系統(tǒng)可能被激活。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道［11-12］HBV 感染時(shí)，IFN-γ和TNF-α這兩種細(xì)胞因子可能是通過降解病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制模板、干擾HBV 共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（HBV covalently closed circular DNA，HBV cccDNA）的完整性和穩(wěn)定性，繼而降低了HBV 的水平，是抑制HBV 復(fù)制的關(guān)鍵。當(dāng)病毒持續(xù)刺激時(shí)，本研究顯示在第24天時(shí)實(shí)驗(yàn)組IFN-γ和TNF-α均明顯低于正常組，表明免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子減少，清除病毒功能可能會(huì)降低。這與既往研究結(jié)果一致：當(dāng)高病毒載量的HBV 持續(xù)存在時(shí)，Th1 類細(xì)胞因子產(chǎn)生減少，如IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子減少，免疫應(yīng)答也會(huì)減弱［10，12-13］。這也可能是免疫耐受期的HBV 感染者體內(nèi)有大量HBV，但肝臟不會(huì)發(fā)生損傷，同時(shí)機(jī)體也不能清除HBV 的原因。

CD8+T 細(xì)胞是有助于清除HBV 的主要免疫細(xì)胞，而細(xì)胞表面上免疫抑制分子的陽性率與慢性肝炎的發(fā)生可能存在相關(guān)性［14］。鑒于此，近年來關(guān)于CD8+T 細(xì)胞上免疫抑制分子的研究越來越多［15-16］。在所有的抑制性受體中關(guān)于PD-1 的研究最多。本次研究比較了PBMCs 在受到HBV 持續(xù)刺激并出現(xiàn)弱的免疫應(yīng)答時(shí)的CD8+T 細(xì)胞的陽性率和未開始刺激時(shí)的陽性率，結(jié)果表明受到病毒持續(xù)刺激的PD-1 陽性率明顯升高，這說明慢性HBV 感染者血清的持續(xù)刺激會(huì)上調(diào)HBV 特異性CD8+T 細(xì)胞上PD-1 的表達(dá)，與先前的研究結(jié)果相同［17］。有研究提出PD-1 的陽性率上升的原因可能是由于長(zhǎng)期抗原刺激將導(dǎo)致CD8+T 細(xì)胞中PD-1啟動(dòng)子的去甲基化，進(jìn)而造成CD8+T 細(xì)胞中PD-1的上調(diào)［18］。近期有研究指出PD-1 和PD-L1 之間的相互作用會(huì)通過誘導(dǎo)T 細(xì)胞凋亡或T 細(xì)胞功能障礙導(dǎo)致肝臟免疫耐受［15］。因此，持續(xù)感染將導(dǎo)致CD8+T 細(xì)胞上PD-1 的陽性率的增加，繼而可能導(dǎo)致肝臟免疫耐受、乙肝的慢性化。

既往的體內(nèi)研究對(duì)HBV 發(fā)病機(jī)制的理解做出了重大貢獻(xiàn)，但動(dòng)物與人類免疫系統(tǒng)的不同導(dǎo)致動(dòng)物與人在HBV 感染時(shí)產(chǎn)生免疫反應(yīng)的差異，這造成對(duì)HBV 感染時(shí)機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答理解的不足［19］。而既往針對(duì)HBV 發(fā)病機(jī)制的體外研究甚少，因此仍需要開展大量的相關(guān)研究。本次實(shí)驗(yàn)利用免疫耐受期的HBV 感染者血清刺激正常人PBMCs 來研究相關(guān)的免疫效應(yīng)，一方面避免了HBV 感染者血清中IFN-γ、TNF-α等炎癥因子對(duì)本實(shí)驗(yàn)的干擾，另一方面也模擬了人體感染HBV 時(shí)的微環(huán)境，這些皆使得對(duì)HBV 感染過程中免疫應(yīng)答的研究更加具有應(yīng)用價(jià)值。然而本次研究仍存在一定的缺陷：HBV 引起的免疫應(yīng)答是由多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子共同參與，本研究只觀察了HBV 感染時(shí)IFN-γ、TNF-α濃度變化，白細(xì)胞介素-4、白細(xì)胞介素-10 等與乙肝感染有關(guān)的細(xì)胞因子則未進(jìn)行研究；CD8+T 細(xì)胞上PD-1 的陽性率也只研究了未開始刺激時(shí)和刺激24 d 后的陽性率，未研究中間的變化過程。但此次實(shí)驗(yàn)依然可反映持續(xù)感染與部分炎癥因子和CD8+T 細(xì)胞上PD-1 陽性率的關(guān)系。

既往研究表明HBV 感染時(shí)引起的免疫反應(yīng)可以抑制HBV 復(fù)制或以非細(xì)胞溶解方式清除HBV［20］。因此，HBV 感染時(shí)機(jī)體免疫效應(yīng)的研究將有利于尋找抑制HBV 復(fù)制的新方法，甚至將有助于實(shí)現(xiàn)世界衛(wèi)生組織制定的到2030年根治乙型肝炎的目標(biāo)［21］。