叢 佳，徐 杰，代艷超，王子康，孫堅(jiān)萍

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院血液內(nèi)科，北京 100730；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京 100069)

轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)[1-2]是目前醫(yī)學(xué)研究中的重點(diǎn)和熱點(diǎn)，而樣本庫(kù)資源庫(kù)則是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的基石和重要組成部分。早在2009年北京市科委正式啟動(dòng)疾病資源庫(kù)項(xiàng)目建設(shè)工作。北京佑安醫(yī)院以肝炎、艾滋病等傳染病人群為主體，建立了肝炎/艾滋病傳染病樣本資源庫(kù)[3-6]。在樣本資源庫(kù)中外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)和血漿是樣本資源庫(kù)儲(chǔ)存的重要樣本。PBMC包括B細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞，單核細(xì)胞等，在評(píng)價(jià)免疫反應(yīng)中至關(guān)重要[7]，在疫苗研究[8-9]和臨床試驗(yàn)中也具有重要意義[10-11]；而血漿中各種細(xì)胞因子對(duì)評(píng)價(jià)機(jī)體炎性反應(yīng)、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移等具有重要作用。在樣本資源庫(kù)中對(duì)送檢標(biāo)本如何處理會(huì)影響標(biāo)本的質(zhì)量。為更好地對(duì)標(biāo)本進(jìn)行質(zhì)量控制，從而有利于后期科學(xué)研究，本研究比較了兩步和三步法分離外周血PBMC和血漿的效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源 收集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院2017年2月至2017年4月送入樣本資源庫(kù)的標(biāo)本，標(biāo)本來(lái)源者均已簽署知情同意書。均為當(dāng)天采集的新鮮抗凝血，無(wú)手術(shù)期輸血、輸液等干擾分離效果的標(biāo)本。

1.2分離外周血PBMC和血漿的方法 用乙二胺四乙酸抗凝管(貨號(hào)367525，BD公司)采集外周血6～8 mL，將送檢標(biāo)本混勻后平均分為2份。一份標(biāo)本直接加入到Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(貨號(hào)AS1114546，Axis-Shield公司)中，2 200 r/min離心20 min后進(jìn)行分離PBMC和血漿提取，即兩步法。見圖1A。一份標(biāo)本2 200 r/min離心7 min后先提取血漿，再加入預(yù)溫的1640培養(yǎng)基(貨號(hào)SH30809.01B，Hyclone公司)稀釋到原來(lái)體積，加入到淋巴細(xì)胞分離液中2 200 r/min離心20 min后分離PBMC，即三步法。見圖1B。分離的PBMC加入適量RPIM-1640混合均勻洗滌后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，而血漿放置于-80 ℃冰箱備用。

注：A表示兩步法；B表示三步法

圖1不同處理方法示意圖

1.3細(xì)胞計(jì)數(shù) 采用吖啶橙(AO)/碘化丙啶(PI)染液(貨號(hào)CS2-0106-5ml，Nexcelom公司)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，AO為浸潤(rùn)性染料(膜通透性)，可侵入活細(xì)胞與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)出綠色熒光、與單鏈DNA(變性DNA)結(jié)合發(fā)出紅色熒光；PI為排斥性染料(膜不通透性)，不能進(jìn)入活細(xì)胞，與死亡或正在死亡(膜通透性改變)的細(xì)胞核酸結(jié)合，發(fā)出紅色熒光。AO/PI雙染色可區(qū)分活細(xì)胞與死亡細(xì)胞。具體操作：取PBMC懸液20 μL，與AO/PI染料按1∶1比例混勻；取20 μL混勻液加入到細(xì)胞計(jì)數(shù)板(貨號(hào)SD100，Nexcelom公司)中，然后插入到自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(cellcounter，Nexcelom公司)中，自動(dòng)計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活性。

1.4檢測(cè)血漿中細(xì)胞因子水平 將凍存的血漿解凍后選取能評(píng)價(jià)炎癥、免疫狀態(tài)、腫瘤發(fā)生的27種血漿細(xì)胞因子，見表2。利用美國(guó)Biorad公司試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明書采用Luminex高通量技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)儀器為美國(guó)Luminex 200液相懸浮芯片系統(tǒng)。

2 結(jié) 果

2.1不同方法分離PBMC效果比較 2種方法分離的活細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)及活細(xì)胞比例結(jié)果相近，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同方法分離PBMC效果比較

2.2不同方法對(duì)血漿細(xì)胞因子水平的影響比較 兩步法血漿細(xì)胞因子水平均低于三步法，除GM-CSF和IP-10外，其余25種細(xì)胞因子比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同方法對(duì)血漿細(xì)胞因子水平的影響比較

續(xù)表2 不同方法對(duì)血漿細(xì)胞因子水平的影響比較

3 討 論

由于樣本資源庫(kù)中的臨床樣本是不可再生的寶貴資源，而高質(zhì)量臨床樣本對(duì)科學(xué)研究具有極其重要的意義[12]。如何科學(xué)、高效、標(biāo)準(zhǔn)化地采集、處理、儲(chǔ)存高質(zhì)量樣本資源，建立高質(zhì)量資源庫(kù)，使之更好地為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)服務(wù)至關(guān)重要[13]。樣本資源庫(kù)中標(biāo)本分離方法對(duì)標(biāo)本質(zhì)量影響較大，本研究比較了兩步和三步法對(duì)PBMC分離和血漿細(xì)胞因子水平的影響。

從操作方面看，兩步法處理時(shí)間短，操作少于三步法。但在PBMC分離效果方面，在活細(xì)胞數(shù)、總細(xì)胞數(shù)及活細(xì)胞比例方面，兩步法與三步法的結(jié)果基本一致，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示在分離PBMC時(shí)可采取兩步法，這樣操作少且省時(shí)。也有研究對(duì)不同PBMC分離技術(shù)方法進(jìn)行了比較，為利用PBMC而進(jìn)行的下游應(yīng)用研究提供了基礎(chǔ)，從而可選擇最佳PBMC分離方法[15]。

本研究比較了2種方法分離后的血漿細(xì)胞因子水平，結(jié)果顯示，兩步法分離血漿中的細(xì)胞因子水平均低于三步法，其中25種細(xì)胞因子比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，從表2可見，采取兩步法分離的血漿大部分細(xì)胞因子水平僅為三步法的2/3，甚至更低，這種差異會(huì)對(duì)后期研究造成極大影響。究其原因，可能在于兩步法分離的血漿，因?yàn)樵诜蛛x血漿前就加入了淋巴細(xì)胞分離液，從而影響了血漿細(xì)胞因子水平，具體機(jī)制尚不清楚，有待于進(jìn)一步的驗(yàn)證研究；而本研究中無(wú)論是兩步法還是三步法，均采用了先進(jìn)的Luminex高通量技術(shù)，其差異應(yīng)該與檢測(cè)技術(shù)無(wú)關(guān)；而檢測(cè)的27種細(xì)胞因子則涵蓋了能反映炎癥、腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移等的各種白細(xì)胞介素、細(xì)胞集落刺激因子、干擾素、血管生長(zhǎng)因子等，則2種方法之間的差異也應(yīng)該不是細(xì)胞因子的選擇差異所致。提示如后期研究涉及血漿細(xì)胞因子水平，那么樣本庫(kù)標(biāo)本的血漿分離應(yīng)采用三步法進(jìn)行處理。

有研究觀察了不同處理時(shí)間、不同處理溫度等條件對(duì)血漿收集的影響，結(jié)果顯示，代謝產(chǎn)物與時(shí)間相關(guān)，隨時(shí)間延長(zhǎng)，代謝產(chǎn)物會(huì)增多，故建議分離血漿應(yīng)在3 h內(nèi)進(jìn)行，在該時(shí)間段內(nèi)代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)很穩(wěn)定[14]。由此可見，在不同實(shí)驗(yàn)條件下分離的血漿質(zhì)量會(huì)有很大差異。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，兩步法與三步法比較，在分離和收集PBMC方面效果類似，且步驟簡(jiǎn)單，可節(jié)省時(shí)間；但兩步法分離的血漿細(xì)胞因子受到很大影響，不能真實(shí)地反映血漿細(xì)胞因子水平。