樊 博,史亮濤,潘志賢,何光熊,孫 毅,閆幫國,*

1 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱區(qū)生態(tài)農(nóng)業(yè)研究所,元謀 651300 2 元謀干熱河谷植物園,元謀 651300

碳氮是生態(tài)系統(tǒng)運(yùn)轉(zhuǎn)的關(guān)鍵元素[1-2]。碳氮交互作用深刻地影響生態(tài)系統(tǒng)的功能以及生態(tài)系統(tǒng)對(duì)全球變化的響應(yīng)[3]。二氧化碳濃度升高可以促進(jìn)植物生長,從而可以固定更多的碳,但是這種促進(jìn)作用與氮元素的豐缺有關(guān)[4]。當(dāng)?shù)饾u限制時(shí),二氧化碳濃度對(duì)植物生長不再具有促進(jìn)作用[5]。

大氣二氧化碳濃度升高和溫度增高對(duì)植物生長的促進(jìn)作用增加了土壤的碳輸入[6]。另一方面,日益增加的大氣氮沉降增加了土壤氮的含量,導(dǎo)致碳可能會(huì)成為土壤生物化學(xué)過程的限制養(yǎng)分。因此,碳氮交互作用同樣可能存在于土壤生態(tài)系統(tǒng)中。碳是許多生態(tài)系統(tǒng)中限制土壤微生物生長的因素,特別是氮添加下的生態(tài)系統(tǒng)中,碳的限制可能更為嚴(yán)重[7]。

土壤酶是影響土壤養(yǎng)分循環(huán)和有機(jī)物分解的重要催化物質(zhì),主要由土壤微生物分泌而來[8]。土壤酶活性反映了土壤的肥力[9],其化學(xué)計(jì)量學(xué)特征反映了土壤養(yǎng)分的平衡狀況[10]。碳氮平衡的改變必然對(duì)土壤酶活性及其化學(xué)計(jì)量學(xué)特征產(chǎn)生重要影響。

土壤酶是促進(jìn)土壤穩(wěn)定有機(jī)碳形成的重要因素[11]。碳源物質(zhì)的水解酶產(chǎn)物被微生物利用后更容易與土壤礦物質(zhì)結(jié)合,進(jìn)而形成穩(wěn)定的土壤有機(jī)碳[12]。然而,外源碳輸入并不一定伴隨土壤碳庫的增加。外源碳可能會(huì)激發(fā)土壤中有機(jī)質(zhì)的分解,產(chǎn)生激發(fā)效應(yīng)(Priming effect)[13]。事實(shí)上,隨著植物生產(chǎn)力的提高和碳輸入的增加,土壤碳庫的分解速率也在增加,從而抵消了碳的輸入[14]。相反,氮增加可能會(huì)促進(jìn)土壤穩(wěn)定有機(jī)碳的形成[15]。這些截然不同的結(jié)果可能與碳氮對(duì)土壤酶活性的影響有關(guān)。因此,認(rèn)識(shí)碳氮對(duì)土壤酶活性的交互作用是了解全球變化下土壤生態(tài)系統(tǒng)功能和生物地球化學(xué)循環(huán)變化趨勢(shì)的關(guān)鍵。

已有研究表明碳、氮交互作用對(duì)生態(tài)系統(tǒng)生產(chǎn)力具有重要的影響[5],那么碳、氮對(duì)土壤酶活性的影響是否存在交互作用？本研究依托干熱河谷的實(shí)驗(yàn)草地,進(jìn)行土壤碳氮添加控制實(shí)驗(yàn),揭示碳氮交互作用對(duì)土壤酶活性的影響。研究結(jié)果將有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)碳氮在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的作用及其耦合機(jī)制,理解生態(tài)系統(tǒng)富氮化后碳氮平衡對(duì)土壤酶活性的影響機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)地概況

實(shí)驗(yàn)地位于金沙江干熱河谷地區(qū)的元謀溝蝕崩塌觀測(cè)站上,年均溫在21℃左右,年降水量低于700 mm,且90%以上分布在雨季(6—10月)。當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)植物為黃茅Heteropogoncontortus、孔穎草Bothriochloapertusa、擬金茅Eulaliopsisbinata和橘草Cymbopogongoeringii等。區(qū)域內(nèi)土壤侵蝕較為嚴(yán)重,導(dǎo)致部分地表的植被破壞和土層混合。為了模擬土壤侵蝕狀況下植被恢復(fù)對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響,選定一個(gè)土壤類型為燥紅土的實(shí)驗(yàn)區(qū),去除植被和表層土壤(0—100 cm),通過推土機(jī)混合后回填部分土壤。土壤全碳含量為2.55 mg/g,全氮含量為0.20 mg/g,全磷含量為0.10 mg/g,pH為6.26左右。整個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)被劃分為12個(gè)區(qū)塊,區(qū)塊面積8 m×16 m。每個(gè)區(qū)塊劃分為8個(gè)樣方,各樣方中配置了不同的植物物種[16]。每個(gè)樣方面積為1.8 m×1.8 m。中間間隔0.4 m,區(qū)塊之間間隔1 m。

為了探明氮添加對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的影響,6個(gè)區(qū)塊每年添加固體分析純NH4NO3,分兩次分別在6月和8月中旬添加,添加量為每年5 g N m-2(大約為區(qū)域大氣沉降背景值[17]的2—3倍左右)。氮添加通常選擇在連陰雨期間進(jìn)行,氮添加時(shí)與少量當(dāng)?shù)厣惩粱靹蚝蟛ト?。另?個(gè)區(qū)塊為對(duì)照,只播撒相應(yīng)量的沙土。氮添加區(qū)塊與對(duì)照區(qū)塊隨機(jī)排列,以消除位置上土壤異質(zhì)性的影響。處理區(qū)塊間隔0.8 m,設(shè)置土埂。該樣地2012年建成,2013年開始進(jìn)行氮添加處理。

2015年10月采集了4種單一種植樣方下(分別為黃茅、孔穎草、擬金茅和橘草)的表層土壤 (0—15 cm)。每個(gè)物種的處理包含10個(gè)樣方,其中5個(gè)為對(duì)照；5個(gè)為氮添加。實(shí)驗(yàn)共含有4個(gè)植物處理×2個(gè)氮處理×5個(gè)重復(fù)=40個(gè)樣方。

1.2 樣品處理與測(cè)定

每個(gè)樣方的土壤稱量2份(100 g風(fēng)干土壤樣品),放入350 mL Mason瓶中,其中一份為對(duì)照,第二份添加碳,為500 mg C kg-1土壤(0.1251 g葡萄糖/100 g土壤)。所有土壤樣品水分含量均調(diào)節(jié)至田間飽和含水量的60%,用封口膜蓋住以降低水分流失,每隔3 d校正一次水分。28℃下暗培養(yǎng),9天后(預(yù)實(shí)驗(yàn)表明碳添加9 d后土壤酶活性趨于穩(wěn)定,與Allison和Vitousek[20]的研究結(jié)果相似)將土壤取出,置于4℃冰箱中保存,用于測(cè)定土壤酶活性。

根據(jù)Sinsabaugh等研究結(jié)果[21],土壤或沉積物中C、N、P水解酶可由β- 1,4-葡萄糖苷酶(BG),酸性磷酸酶(AP),幾丁質(zhì)酶(NAG)和亮氨酸氨基肽(LAP)表征,具體測(cè)定方法參照[22]。β- 1,4-葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶和幾丁質(zhì)酶測(cè)定方法相似,底物分別為對(duì)硝基苯-β-吡喃葡萄糖苷、對(duì)硝基苯磷酸二鈉和對(duì)硝基苯β-N-乙酰葡糖胺糖苷,用pH 5.0的50 mmol/L醋酸緩沖液配制濃度為2.5 mmol/L的底物溶液(由于對(duì)硝基苯β-N-乙酰葡糖胺糖苷極難溶解,底物溶液的濃度為1 mmol/L)。在測(cè)定土壤酶活性前將土壤充分混勻。預(yù)實(shí)驗(yàn)表明土壤太多,反應(yīng)底物不足會(huì)限制反應(yīng)速率；土壤太少,反應(yīng)產(chǎn)物顯色太弱。因此本研究進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)來測(cè)定不同土壤重量下酶活性的倍性關(guān)系和重復(fù)性,以確定合適的土壤量(AP為0.15 g左右；LAP 0.35 g左右；NAG 0.2 g左右；BG 0.2 g左右)。測(cè)定的具體步驟是：稱量土壤并記錄重量,放入10 mL離心管中,再加入4 mL底物溶液；用4 mL緩沖液加土壤作為土壤對(duì)照；同時(shí)設(shè)置底物對(duì)照(不加土壤)。20℃培養(yǎng)結(jié)束3—4 h后離心3 min。提取上清液2.5 mL,加入0.25 mL 1 mol/L NaOH終止反應(yīng)和顯色,在410 nm處測(cè)定吸光度,用不同濃度對(duì)硝基酚作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。亮氨酸氨基肽酶測(cè)定中采用L-亮氨酸- 4-硝基苯胺作為底物,以pH為8.0的50 mmol/L Tris緩沖液配制1 mmol/L的底物溶液。在10 mL離心管中加入0.1 g左右的新鮮土壤,加入4 mL 1 mmol/L的底物溶液；同時(shí)設(shè)置底物對(duì)照和土壤對(duì)照,所有樣品培養(yǎng)4 h。由于該底物對(duì)氫氧化鈉很敏感,極易分解,另外pH 8.0緩沖液已經(jīng)可以使對(duì)硝基酚顯色,因此本指標(biāo)是培養(yǎng)結(jié)束后直接在分光光度計(jì)410 nm處測(cè)定吸光度。定量方法也是用不同濃度對(duì)硝基酚作為標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶活性為樣品測(cè)定值減去土壤對(duì)照和底物對(duì)照,用nmol對(duì)硝基酚 g-1h-1表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

初步分析后發(fā)現(xiàn)植物物種與碳或氮之間均不存在顯著的交互作用。因此本文將不同物種處理合并,只關(guān)注碳氮的作用及其交互作用。土壤酶C∶N化學(xué)計(jì)量學(xué)特征用ln(BG)∶ln(LAP+NAG)表征；C∶P用ln(BG)∶ln(AP)；N∶P用ln(LAP+NAG)∶ln(AP)表征[21]。用最小顯著差異法(LSD)比較碳氮處理間的差異；采用方差分析法分析碳氮處理及其交互作用對(duì)土壤酶活性的影響。為了揭示碳氮添加對(duì)土壤土壤酶活性變化的關(guān)聯(lián)性影響,計(jì)算了土壤酶活性在碳添加后的變化值(碳添加后土壤酶活性減去沒有碳添加的對(duì)應(yīng)值),并采用線性回歸分析法分析碳添加后酶活性變化值與土壤初始有效氮含量之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳氮處理對(duì)土壤酶活性的影響

氮添加顯著增加了土壤中有效氮含量,使有效氮含量平均值由4.47 mg/kg增加至11.67 mg/kg。施氮處理顯著影響了土壤AP和LAP活性(表1)。氮添加下AP活性由542.63 nmol g-1h-1增加至1143.77 nmol g-1h-1；LAP活性則由29.60 nmol g-1h-1降至24.14 nmol g-1h-1,降低了18.4%；碳添加顯著影響了AP、LAP和NAG活性,三者分別由407.20、21.92、20.56 nmol g-1h-1增加至1279.19、31.82和31.59 nmol g-1h-1,分別增加了214.1%、45.2%和53.7% (圖1)。

圖1 碳氮添加下土壤酶活性(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)Fig.1 Soil enzyme activities (Mean±SE) under carbon and nitrogen additionsBG, β- 1,4-葡萄糖苷酶β- 1,4-glucosidase; NAG, 幾丁質(zhì)酶Chitinase;LAP亮氨酸胺肽酶Leucine aminopeptidase; AP, 酸性磷酸酶Acid phosphatase; 不同字母表示組間存在顯著差異

碳氮交互作用顯著影響了BG、AP和LAP活性 (表1)。在對(duì)照樣方的土壤中,碳添加使BG活性由63.01 nmol g-1h-1降至43.24 nmol g-1h-1,降低了31.4%；在施氮樣方的土壤中,碳添加使BG活性由48.09 nmol g-1h-1增加至74.27 nmol g-1h-1,增加了54.4%。對(duì)照樣方中,碳添加AP和LAP活性影響較小,碳添加使AP活性為由358.88 nmol g-1h-1增加至726.38 nmol g-1h-1,使LAP活性由25.88 nmol g-1h-1增加至33.32 nmol g-1h-1,二者分別增加了102.4%和28.8%；而施氮樣方的土壤中,碳添加下AP活性由455.53 nmol g-1h-1增加至1832.01 nmol g-1h-1,LAP活性由17.96 nmol g-1h-1增加為30.32 nmol g-1h-1,分別增加了302.2%和68.8% (圖1)。回歸分析表明,碳添加下AP和BG酶活性增加值與土壤初始有效氮含量顯著正相關(guān) (圖2),其他酶活性增加值與土壤初始有效氮含量不相關(guān)。

圖2 碳添加下土壤酶活性變化與土壤初始有效氮含量之間的關(guān)系Fig.2 Relationships between changes in soil enzyme activities and soil initial nitrogen availabilities under carbon additions

2.2 碳氮處理對(duì)C∶N∶P土壤酶化學(xué)計(jì)量學(xué)特征的影響

施氮處理顯著降影響了土壤C∶P和N∶P水解酶化學(xué)計(jì)量關(guān)系 (表1)。氮添加下ln(BG)∶ln(AP)和ln(LAP+NAG)∶ln(AP)顯著下降,分別由0.62和0.63降低為0.59和0.56。碳添加顯著影響了C∶N和C∶P的水解酶化學(xué)計(jì)量關(guān)系(表1)。碳添加顯著降低了ln(BG)∶ln(LAP+NAG)和ln(BG)∶ln(AP),使其分別由1.07和0.65降低為0.97和0.56 (圖3)。

表1 碳(C)、氮(N)及其交互作用對(duì)土壤酶活性的影響

BG, β- 1,4-葡萄糖苷酶β- 1,4-glucosidase; NAG, 幾丁質(zhì)酶Chitinase;LAP亮氨酸胺肽酶Leucine aminopeptidase; AP, 酸性磷酸酶Acid phosphatase

圖3 碳氮添加下土壤酶化學(xué)計(jì)量學(xué)特征(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)
Fig.3 Soil enzymatic stoichiometry under carbon and nitrogen additions (Mean±SE)

碳氮交互作用顯著影響了C∶N和C∶P的水解酶化學(xué)計(jì)量關(guān)系 (表1)。在對(duì)照樣方中碳添加使ln(BG)∶ln(LAP+NAG)由1.08降低為0.90,降低了16.9%；ln(BG)∶ln(AP)由0.69降低至0.56,降低了19.9%；而在施氮樣方土壤中,碳添加下ln(BG)∶ln(LAP+NAG)由1.06降低為1.04,僅降低了1.9%；ln(BG)∶ln(AP)由0.60降低為0.57,僅降低了5.8% (圖3)。

3 討論

3.1 碳對(duì)土壤酶活性的限制

本研究發(fā)現(xiàn),碳對(duì)土壤酸性磷酸酶、幾丁質(zhì)酶和亮氨酸胺肽酶活性具有較大的促進(jìn)作用,表明碳是干熱河谷土壤酶活性的限制因素。碳可以為土壤微生物的土壤酶合成提供能量,同時(shí)碳也是構(gòu)成土壤酶的關(guān)鍵元素[8]。干熱河谷植物生產(chǎn)力較低,土壤中有機(jī)質(zhì)較為缺乏,導(dǎo)致土壤中可供微生物利用的碳不足,這在氮添加后可能顯得更為突出。土壤酶活性是土壤養(yǎng)分循環(huán)的重要驅(qū)動(dòng)力[10],也是土壤肥力的重要指標(biāo)。碳對(duì)土壤酶活性的限制也可能存在其他生態(tài)系統(tǒng)中。全球范圍的綜合數(shù)據(jù)顯示,根際土壤的土壤酶活性總體上可以比非根際土壤高出28%[23],根際土中的土壤酶活性增強(qiáng)的現(xiàn)象可能與根系分泌的碳化合物有關(guān)。事實(shí)上,植物根際土壤酶活性與根系的碳分泌量顯著正相關(guān)[24],表明碳對(duì)多數(shù)生態(tài)系統(tǒng)中的土壤酶活性都可能具有限制作用。

3.2 碳氮交互作用對(duì)土壤酶活性的影響

碳氮交互作用表明碳對(duì)部分土壤酶活性的影響與氮有關(guān)。當(dāng)碳氮添加后,土壤中的磷的限制作用日益突出,土壤微生物為了獲取更多的磷從而合成酸性磷酸酶,促進(jìn)磷從有機(jī)物中釋放。這就表明植物根系分泌物或者植物枯落物對(duì)土壤酶活性的促進(jìn)作用可能與氮含量有關(guān)。而另一方面,植物根系通過吸收土壤氮,造成根系周圍氮的缺乏,這可能會(huì)影響根系分泌物對(duì)部分土壤酶活性的促進(jìn)作用。相反,豐富的氮含量則可以加速磷的循環(huán)[25]。在氮沉降下,土壤中的氮含量不斷增加,這將改變根際土壤的酶活性及其化學(xué)計(jì)量學(xué)特征,從而對(duì)植物養(yǎng)分吸收和土壤碳氮磷循環(huán)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。

碳氮交互作用同樣存在于β- 1,4-葡萄糖苷酶和亮氨酸胺肽酶,碳添加對(duì)這些土壤酶活性的促進(jìn)作用主要發(fā)生在氮添加土壤中。β- 1,4-葡萄糖苷酶是水解纖維素的酶[10],可以為微生物提供必需的碳水化合物。本研究中添加葡萄糖使得碳對(duì)微生物生長的限制作用降低,從而降低了β- 1,4-葡萄糖苷酶活性。但是,在氮添加樣方中,微生物對(duì)碳的需求仍然較大,促使微生物繼續(xù)合成β- 1,4-葡萄糖苷酶。此外,碳添加還可能緩解了土壤對(duì)微生物生長的限制因素[7],極大地增加了氮添加土壤中的微生物量,導(dǎo)致β- 1,4-葡萄糖苷酶活性增高。

氮添加降低了亮氨酸胺肽酶活性,這與微生物分配的經(jīng)濟(jì)理論[26]相符。亮氨酸胺肽酶是氮循環(huán)的關(guān)鍵酶,可以降有機(jī)態(tài)氮分解,從而為植物和微生物提供可利用的無機(jī)態(tài)氮。氮添加以后,土壤中的無機(jī)態(tài)氮含量逐漸升高,氮元素不再是限制養(yǎng)分,因此可能造成土壤微生物對(duì)氮循環(huán)的酶合成下降。然而,碳添加對(duì)亮氨酸氨肽酶活性的促進(jìn)作用與土壤初始氮含量并無顯著關(guān)聯(lián),表明其他因素可能影響了碳添加的效應(yīng),比如土壤pH[27]。

已有的研究表明氮添加對(duì)土壤酶活性的影響存在很大的不確定性,存在正效應(yīng)、負(fù)效應(yīng)、或者沒有作用[28]。氮添加對(duì)不同生態(tài)系統(tǒng)土壤酶活性的影響存在很大不同[29],這是否與不同生態(tài)系統(tǒng)的土壤碳限制程度有關(guān)呢？本文的研究結(jié)果表明：碳氮交互作用決定了土壤酶活性。碳源充足的土壤中亮氨酸胺肽酶活性不受氮添加的影響,而β- 1,4-葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶活性則會(huì)受到氮添加的促進(jìn)；而在碳源不足的環(huán)境中,氮添加則會(huì)降低亮氨酸胺肽酶活性,而對(duì)β- 1,4-葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶活性的促進(jìn)作用較小或者沒有促進(jìn)作用。此外,碳氮交互作用可能也是有機(jī)肥對(duì)土壤酶活性促進(jìn)作用大于化學(xué)肥料[30- 32]的原因,畢竟有機(jī)肥含有大量的碳源物質(zhì)。因此,以后的研究應(yīng)當(dāng)關(guān)注碳氮交互作用對(duì)土壤酶活性的影響。

由于碳、氮對(duì)不同酶活性影響的差異,導(dǎo)致了土壤碳氮磷水解酶化學(xué)計(jì)量學(xué)特征的變化?？傮w上碳添加降低了C∶N和C∶P的水解酶活性比,氮添加增加了C∶N的水解酶活性比,但是降低了N∶P的水解酶活性比,這與微生物分配的經(jīng)濟(jì)學(xué)理論相一致[26],即微生物傾向于分泌相關(guān)的酶來水解更為稀缺的養(yǎng)分。

4 結(jié)論

碳氮交互作用顯著影響了干熱河谷土壤的酸性磷酸酶、β- 1,4-葡萄糖苷酶和亮氨酸胺肽酶活性。碳添加對(duì)土壤酸性磷酸酶和β- 1,4-葡萄糖苷酶活性的促進(jìn)作用與土壤氮含量有關(guān)。碳氮交互作用對(duì)土壤酶化學(xué)計(jì)量學(xué)特征也具有顯著影響,碳添加雖然降低了對(duì)照樣方C∶N和C∶P的水解酶活性比,但是在氮添加樣方的土壤中這種效應(yīng)不再顯著,表明碳氮交互作用可能會(huì)影響該地區(qū)土壤碳氮磷循環(huán)的平衡。土壤酶化學(xué)計(jì)量學(xué)特征反映了土壤中的養(yǎng)分平衡,是影響土壤生物地球化學(xué)過程的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。碳氮交互作用的影響,表明在研究和認(rèn)識(shí)生物地球化學(xué)循環(huán)中,需要更多維的角度,注重多元養(yǎng)分的交互作用。