呂建偉,李小鵬,謝振麗,朱 琨,謝志剛,徐興軍,王昌河,,*

1 齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院, 齊齊哈爾 161006 2 西安交通大學生命科學與技術(shù)學院, 西安 710049

寒冷是北方野生小哺乳動物經(jīng)常遇到的環(huán)境壓力, 溫度作為自然環(huán)境中最重要的影響因子之一, 對動物的生長發(fā)育、取食消化、代謝產(chǎn)熱與繁殖活動等都會產(chǎn)生顯著的影響[1- 4]。作為動物處理、消化、吸收食物和獲得能量的重要器官,消化道的形態(tài)結(jié)構(gòu)直接影響動物對食物的攝取和能量的吸收,進而影響其生長發(fā)育與繁殖。消化道大小和形態(tài)的自我調(diào)節(jié)是動物獲能策略的重要組成部分,是動物對外界環(huán)境條件與自身生理需求作出的響應和適應性調(diào)整,其變化與環(huán)境溫度、食物質(zhì)量[5-8]以及繁殖狀況[9-10]等因素密切相關(guān)。因此,研究長期冷暴露下小型嚙齒動物消化道形態(tài)與組織結(jié)構(gòu)的變化不僅有助于理解小型動物在低溫環(huán)境下的取食與消化對策,還對理解生物在極端溫度環(huán)境下的能量代謝及其適應性調(diào)整具有重要的生物學意義。

小型動物主要通過消化道容積的改變和消化道壁組織結(jié)構(gòu)的改變來調(diào)節(jié)其形態(tài)結(jié)構(gòu),以適應其在不同環(huán)境及其不同生理條件下的能量需求。在環(huán)境溫度低、能量需求增加或食物質(zhì)量下降的情況下,為滿足代謝需求,小型恒溫動物通常會增加消化道容積或道壁組織結(jié)構(gòu)以提高攝食量或提高消化效率。如, 張志強和王德華[11]對能蒙古太仆寺旗的長爪沙鼠腸道長度的季節(jié)變化進行了系統(tǒng)研究,發(fā)現(xiàn)其小腸和大腸長度在春冬季最長、夏季最短。朱萬龍等[12]發(fā)現(xiàn)橫斷山區(qū)大絨鼠小腸和盲腸長度隨溫度降低而顯著增加。Del Valle等[13]則發(fā)現(xiàn)冷暴露條件下南美原鼠(Akodonazarae)小腸的長度和鮮重均大于對照組。宋志剛等人[14]發(fā)現(xiàn)長期冷暴露孕鼠(Microtusbrandti)的胃、小腸、盲腸和結(jié)腸鮮重明顯高于溫暖環(huán)境下的孕鼠和非繁殖期雌鼠。目前大多的研究報道主要集中在消化道的長度及重量的變化上,認為較長的消化道長度意味著較大的腸腔容量,而較大的鮮重和干重則代表較復雜的腸道微結(jié)構(gòu)和更為有效的消化與吸收效率[13]。

腸道是由腸絨毛、腸腺、毛細血管、毛細淋巴管及內(nèi)層環(huán)肌與外層縱肌等組成的多層次的復雜而精密的組織結(jié)構(gòu),這些結(jié)構(gòu)的可變性與多變性是引起腸道組織針對外界環(huán)境做出適應性調(diào)整的重要方式。一般認為消化道容積的改變可能是由消化道長度或管徑的變化引起的,而其組織結(jié)構(gòu)的變化主要表現(xiàn)為微絨毛數(shù)量、漿膜厚度、管壁厚度及其他組織結(jié)構(gòu)的變化。因此,長度和重量兩個簡單的指標無法真正體現(xiàn)腸道組織精細而復雜的可塑性變化[15]。如,Dou等的研究結(jié)果表明限制飲食將導致大鼠小腸萎縮,表現(xiàn)為絨毛長和隱窩深的顯著降低[16]。 Samanya和Yamauchi發(fā)現(xiàn)喂食B. subtilis natto會抑制氨的產(chǎn)生、促進細胞有絲分裂進而導致小腸絨毛長度增加[17]。眾所周知，低溫條件可以引起小型哺乳動物能量需求的增加，然而, 小型哺乳類腸道組織結(jié)構(gòu)的變化目前還不清楚。本研究對小鼠各腸道組織結(jié)構(gòu)(消化道各器官的長度、鮮重、干重以及十二指腸的腸壁總厚度、絨毛高度、內(nèi)半徑、外半徑)在長期冷暴露條件下所做出的適應性變化進行了系統(tǒng)分析,不僅對長期處于低溫條件下的小鼠消化道形態(tài)變化研究,同時對小鼠消化道形態(tài)及其組織結(jié)構(gòu)-橫截面積在低溫環(huán)境下的適應性調(diào)整進行了系統(tǒng)研究,這為深入理解小型哺乳類在低溫環(huán)境下的消化策略及其適應模式具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物為20日齡的昆明小鼠,將其隨機分為常溫對照飼養(yǎng)組(25℃)和低溫飼養(yǎng)組(10℃)飼養(yǎng),除溫度外其他飼養(yǎng)條件相同。飼養(yǎng)過程中每日打掃鼠舍,添加鼠糧(江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司)及清水,每5日采用精度為1 g的電子秤測量小鼠體重,共馴化3個月。

1.2 消化道形態(tài)結(jié)構(gòu)測量

按0.6 mL/100 g體重腹腔注射10%的水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)將實驗小鼠進行麻醉,首先使用300 mL的生理鹽水進行心臟灌流,原則是先快后慢。生理鹽水灌流結(jié)束后,改用200 mL 4% 的多聚甲醛進行預固定,小心的取出胃腸器官,置于生理鹽水中,分離出胃(stomach,ST)、小腸(small intestine,SI)、大腸(large intestine,LI)及盲腸(caecum,CA),小心剔除腸系膜及其他組織,以生理鹽水沖凈內(nèi)容物,平展為最大長度,但不要拉伸,采用精度為1 mm的軟尺測量小腸、盲腸、大腸的長度(length, L),胃長采用精度為0.02 mm的游標卡尺進行測量；取十二指腸近胃2 cm處的片段,置于10%的甲醛溶液中固定,以備組織切片；用濾紙吸干剩余部分后用精度為0.1 mg的電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司,BSA6202S-CW)稱取各器官鮮重(empty,E)；然后將各器官置于60℃烘箱內(nèi)烘干12 h,待重量穩(wěn)定后稱其重量并記錄。

1.3 消化道組織結(jié)構(gòu)觀察與測量

十二指腸為食物消化與營養(yǎng)吸收的主要場所,因此本研究采用十二指腸作為主要實驗材料,經(jīng)12—24 h的固定后,經(jīng)常規(guī)的水洗、脫水、透明、浸蠟和包埋處理,在室溫下用德國Leica組織切片設(shè)備進行切片,切片厚度約8m,切片用蘇木精-伊紅染色法進行染色,封固后用德國Zeiss激光掃描共聚焦顯微鏡LSM510進行觀察。選取絨毛完整、走向平直的經(jīng)典視野采集圖像,并用Zeiss LSM Image Browser (Version 3.0)進行定量分析,測定腸道截面積、腸腔截面積、腸壁總厚度、絨毛高度、絨毛寬度、直腸的環(huán)肌層厚度和縱肌層厚度等生理指標,進行統(tǒng)計分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

成像數(shù)據(jù)使用Zeiss LSM Image Browser(Version 3.0)和MBF ImageJ(NIH)進行統(tǒng)計和分析,各指標均以平均值±標準差(Mean ± SE)表示,采用Student′st-test進行統(tǒng)計學檢驗,P<0.05被認為是差異顯著。所有統(tǒng)計分析借助SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 消化道的形態(tài)學變化

常溫及低溫組小鼠的體尺測量及消化道各器官(胃、小腸、大腸、盲腸)的長度、鮮重與干重測量結(jié)果如表1所示。低溫飼養(yǎng)小鼠的體重(P<0.05)、消化道總長(P<0.01)均明顯增加。胃長、胃鮮重、胃干重在兩組小鼠之間均未表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05),提示胃容量和組織結(jié)構(gòu)對外界環(huán)境溫度變化的敏感性較低。低溫組小鼠的小腸長度顯著增加(P<0.001),但其鮮重卻明顯降低(P<0.05)。低溫小鼠大腸的長度和鮮重均未發(fā)生顯著變化(P>0.05),其干重顯著增加(P<0.05)。在長期冷暴露下,小鼠盲腸的長度顯著增加(P<0.05)、但其鮮重和干重卻未發(fā)生顯著變化(P>0.05)。

表1 常溫與低溫組小鼠消化道形態(tài)結(jié)構(gòu)比較

*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001

2.2 十二指腸組織結(jié)構(gòu)變化

運用組織切片技術(shù)分別對兩組小鼠十二指腸的外徑截面積、內(nèi)徑截面積、外徑截面積-內(nèi)徑截面積、絨毛長度、絨毛寬度和腸壁總厚度以及直腸的截面積、環(huán)肌層厚度和縱肌層厚度進行觀察和比較(圖1),進而分析長期冷暴露對小鼠消化道各項組織學指標的影響,統(tǒng)計結(jié)果見表2。低溫組小鼠的腸道和腸壁組織截面積均顯著減少(P<0.05),而腸腔隙截面積則未發(fā)生顯著變化(P>0.05),暗示其腸道組織在低溫環(huán)境下發(fā)生萎縮。與此相一致,低溫組小鼠的腸壁厚度也顯著減小(P<0.05)。與腸壁厚度降低相反,低溫組小鼠的絨毛高顯著增加(P<0.001),而其寬度則未發(fā)生明顯變化(P>0.05),提示其黏膜層厚度增加,而黏膜下層結(jié)構(gòu)則趨于萎縮。在低溫飼養(yǎng)條件下,小鼠十二指腸的肌肉層厚度顯著增加(P<0.01)。

圖1 常溫與低溫飼養(yǎng)小鼠十二指腸的組織切片F(xiàn)ig.1 Representative micro-graphs of duodenal sections of mice maintained at 25℃ (Control) or 10℃The intestinal tissue was fixed with 10% formaldehyde solution, dehydrated in ascending series of ethanol, cleared in xylene, embedded in paraffin, sectioned, and stained with haematoxylin and eosin. The sections were observed with a Laser Scanning Confocal Microscope (LSM510, Zeiss). Scale bars: 500 μm for upper panels, 200 μm for middle panels, and 50 μm for lower panels

指標Item低溫組Lower temperature 10℃常溫對照組 Control 25℃P腸道截面積 Section area/mm22.9059±0.14903.4851±0.19430.038*腸腔截面積 Lumen area/mm20.3693±0.05400.3599±0.02380.888腸壁截面積 Wall area/mm22.5066±0.12093.1253±0.18180.021*腸壁厚 Wall thickness/μm550.3±11.94589.7±13.240.044*絨毛高 Villus height/μm409.7±12.89330.0±12.920.0001***絨毛寬 Villus width/μm76.1±3.6283.5±2.720.11肌層厚 Muscle thickness/μm17.5±0.9713.9±0.780.002**

*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001

3 討論

寒冷是北方野生小哺乳動物冬季生存所要面臨的最重要的環(huán)境壓力之一, 作為動物處理、消化、吸收食物和獲得能量的重要器官,消化道的形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出極大的可塑性,以適應它們在低溫環(huán)境下的能量獲取與分配的需求。然而,小型哺乳類腸道組織結(jié)構(gòu)是如何隨外界環(huán)境變化而發(fā)生相應的適應性調(diào)整的目前還不清楚。本研究首次對小鼠消化道形態(tài)及其組織結(jié)構(gòu)在低溫環(huán)境下的適應性調(diào)整進行了系統(tǒng)研究,結(jié)果表明,低溫小鼠腸道組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)及組織結(jié)構(gòu)均已經(jīng)產(chǎn)生了適應性調(diào)整,它們主要通過增加消化道的長度和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收面積來增加食物攝取量、營養(yǎng)的吸收速率和吸收效率等,進而滿足其在低溫條件下能量需求的增加。

低溫飼養(yǎng)小鼠的體重(P<0.05)、消化道總長(P<0.01)均顯著增加,表明小鼠可能在寒冷環(huán)境下對能量需求很高,并通過提高消化道容納能力而獲得更多的能量。同時,低溫組小鼠的小腸長度顯著增加(P<0.001),腸腔橫截面積沒有發(fā)生明顯變化,提示小鼠腸道容量明顯增加,表明小鼠在寒冷環(huán)境下主要通過提高食物在小腸中的滯留時間和消化吸收面積而獲得能量收支。低溫組小鼠盲腸長度顯著增加(P<0.05),暗示在寒冷環(huán)境下代謝率下降、食物利用率低下,小鼠可能通過增加盲腸長度而額外獲得部分能量。胃長、胃鮮重、胃干重在兩組小鼠之間均未表現(xiàn)出顯著性差異(P>0.05),提示胃容量和組織結(jié)構(gòu)對外界環(huán)境溫度變化的敏感性較低。小腸,十二指腸,盲腸在寒冷環(huán)境下的變化表明消化道的形態(tài)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出極大的可塑性,以適應它們在低溫環(huán)境下的能量需求。

十二指腸的組織結(jié)構(gòu)測量結(jié)果表明,低溫組小鼠的腸道和腸壁組織截面積均顯著減少(P<0.05),而腸腔隙截面積則未發(fā)生顯著變化(P>0.05),暗示其腸道組織在低溫環(huán)境下發(fā)生萎縮。與此相一致,低溫組小鼠的腸壁厚度也顯著減小(P<0.05)。與腸壁厚度降低相反,低溫組小鼠的絨毛高顯著增加(P<0.001),而其寬度則未發(fā)生明顯變化(P>0.05),提示其黏膜層厚度增加,而黏膜下層結(jié)構(gòu)則趨于退化,表明小鼠在寒冷環(huán)境下通過提高消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力而增加能量獲取。在低溫飼養(yǎng)條件下,小鼠十二指腸的肌肉層厚度顯著增加(P<0.01),表明小鼠在寒冷環(huán)境下可以增加消化道蠕動力而增加消化與吸收效率。這些研究結(jié)果表明,小型哺乳動物在寒冷環(huán)境下主要通過提高腸道組織的容納量與黏膜層厚度及腸道蠕動能力等來提升單次攝食量、食物消化與營養(yǎng)吸收效率等來滿足其高體溫調(diào)節(jié)價下的能量需求。

綜上所述,本研究首次在組織水平研究了小型哺乳動物的消化道結(jié)構(gòu)及其消化策略在低溫環(huán)境下的適應性調(diào)整,它們主要通過增加消化道長度、腸道表面積及肌肉層厚度等來提高其食物消化和營養(yǎng)吸收效率,以便更好地適應環(huán)境溫度變化導致的能量需求變化。