劉 海,王玉書,焦玉潔,彭麗媛,郭明全,王 勇,陳玉藍(lán),袁 玲,*

1 西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院,重慶 400716 2 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技信息研究所,貴陽 550006 3 四川省煙草公司涼山州公司,西昌 615000

紫莖澤蘭(Eupatoriumadenophorum)屬菊科澤蘭屬雜草,原產(chǎn)中美洲。20世紀(jì)40年代從中緬邊境傳入我國,現(xiàn)已遍布云南、貴州、四川、重慶和廣西等西南地區(qū),并以每年30—60 km的速度向我國東部和北部蔓延[1]。目前,人們采用化學(xué)、生物、人工等多種方法防除紫莖澤蘭,但效果欠佳,難于有效遏制其蔓延[2- 5]。

土壤是植物生長的場(chǎng)所,二者之間相互作用和影響。根際土壤的理化生物學(xué)性質(zhì)直接影響植物吸收水分、養(yǎng)分和生長發(fā)育；另一方面,根系生命活動(dòng)深刻改變根際環(huán)境的物理、化學(xué),尤其是微生物學(xué)性質(zhì)。在紫莖澤蘭侵入過程中,土壤自生固氮菌、氨氧化細(xì)菌和真菌數(shù)量增加,氮磷有效性提高,有益于養(yǎng)分吸收[6- 9]。紫莖澤蘭根際還存在拮抗病原微生物的細(xì)菌群落,使其免患土傳病害[10]。因此,從土壤微生物的角度看,紫莖澤蘭存在自我促進(jìn)的侵入機(jī)制[11]。但祖元?jiǎng)偟萚12]報(bào)道,在紫莖澤蘭根際土壤中,真菌和細(xì)菌的數(shù)量顯著低于喜樹,其蔓延擴(kuò)散不改變土壤真菌和細(xì)菌的多樣性。此外,紫莖澤蘭還通過根系分泌、植株殘?bào)w和降雨淋溶向土壤中大量釋放化感物質(zhì),如單萜類、倍半萜類、甾體類、三萜類、苯丙素類、黃酮類及各類衍生物等[13- 14]。其中,澤蘭酮、香葉醛、香茅醛、香豆素、乙酸龍腦酯和樟腦等含量較高,對(duì)微生物具有選擇毒性,導(dǎo)致土壤細(xì)菌數(shù)量減少,真菌和放線菌數(shù)量增加[15- 16]。盡管紫莖澤蘭分泌的部分化感毒物含有苯、奈、菲、蒽等多環(huán)芳烴,但假單胞菌(Pseudomonas)、反硝化產(chǎn)堿菌(Alcaligenesdenitrificans)、諾卡氏菌(Nocardia)、解環(huán)菌(Cycloclasticus)、多色節(jié)桿菌(Arthrobacterpolychromogenes)和乙酸鈣不動(dòng)桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)等土壤微生物能利用其中的碳、氮而使其降解,故對(duì)其生長和繁殖影響不大[17- 18]。由此可見,紫莖澤蘭入侵對(duì)土壤微生物的影響十分復(fù)雜,目前尚無定論。

微生物是土壤的重要組成部分,參與土壤有機(jī)質(zhì)循環(huán),養(yǎng)分轉(zhuǎn)化,結(jié)構(gòu)形成、毒物降解等物理、化學(xué)和生物學(xué)過程,與土壤健康質(zhì)量密切相關(guān)[19-21]。紫莖澤蘭殘?bào)w和根系分泌物進(jìn)入土壤后,可能影響微生物繁殖、生長和新陳代謝,進(jìn)而改變微生物數(shù)量、活性和群落結(jié)構(gòu)。明確紫莖澤蘭對(duì)土壤微生物的影響有益于揭示其侵入機(jī)制,為有效防除紫莖澤蘭提供科學(xué)依據(jù)。四川省涼山州是紫莖澤蘭入侵的重災(zāi)區(qū),危害面積超過幅員面積的20%。試驗(yàn)選擇當(dāng)?shù)氐闹饕寥?紅壤,黃壤和紫色土,采用常規(guī)與高通量測(cè)序技術(shù),研究了紫莖澤蘭根際和非根際土壤(距離根系約20 cm)的酶活性和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究地點(diǎn)位于四川省涼山州西昌市(27°47′—28°02′N,102°10′—102°16′E),屬亞熱帶高原印度洋季風(fēng)氣候,年均日照2423.1 h,年均雨量1013.1 mm,5月中旬—10月中旬的降雨量約占全年的90%,年均蒸發(fā)量1945 mm。當(dāng)?shù)氐闹饕寥李愋蜑榧t壤、黃壤和紫色土,是涼山州紫莖澤蘭分布最廣和面積最大的地區(qū)之一。

1.2 樣地選擇及取樣

每年8月中旬是當(dāng)?shù)刈锨o澤蘭生物量最大的時(shí)期。試驗(yàn)于2016年8月中旬進(jìn)行,分別選擇典型、具有代表性的紅壤、黃壤和紫色土(表1),分別在紫莖澤蘭生長茂盛、形成單優(yōu)種群的每種土壤上,各選擇5個(gè)10—15 m2的樣地,在每個(gè)樣地內(nèi)選5點(diǎn)用抖根法采集根際土壤,并在紫莖澤蘭群體外約20 cm處的空地選擇5點(diǎn)同步采集非根際土壤,充分混勻并揀除雜物,置于冰盒,迅速帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定微生物量碳氮,剩余土樣一分為二,一份風(fēng)干過篩,備測(cè)土壤酶活性(過氧化氫酶、酸性磷酸酶、脲酶、蔗糖酶)；另一份-20℃保存,用于細(xì)菌高通量測(cè)序。

表1 紫莖澤蘭樣地的地理信息

1.3 測(cè)定方法

采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提,重鉻酸鉀氧化法和靛酚藍(lán)比色法分別測(cè)定土壤微生物量碳、氮[22]。分別采用靛酚藍(lán)比色法、3,5-二硝基水楊酸比色法、磷酸苯二鈉法和高錳酸鉀滴定法測(cè)定脲酶、蔗糖酶、酸性磷酸酶和過氧化氫酶活性[17]。其中,過氧化氫酶活性用20 min每克土壤分解的過氧化氫(毫升)表示,脲酶、蔗糖酶及酸性磷酸酶活性則依次用24 h每克土壤產(chǎn)生的NH3-N、葡萄糖和酚(毫克)表示。

取-20℃保存的新鮮土樣,參照454高通量測(cè)序方法,用E.Z.N.A Soil DNA試劑盒(OMEGA,USA),提取土壤基因組,純化后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA大小及片段完整性,NanoDrop2000檢測(cè)DNA純度,TBS- 380檢測(cè)DNA濃度。用ABI GeneAmp? 9700型 PCR 儀,擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3—V4區(qū),引物為338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA- 3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3′)。PCR反應(yīng)體系：FastPfu緩沖液4.0 μL、dNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μL、引物(5 μmol/L)各0.8 μL、FastPfu聚合酶0.4 μL、BSA 0.2 μL、模板DNA10 ng、補(bǔ)ddH2O至20 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共28個(gè)循環(huán),72℃終延伸10 min結(jié)束。每個(gè)樣品重復(fù)3次,將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠再次電泳檢測(cè),用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒(AXYGEN,USA)切膠回收PCR產(chǎn)物,并用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)定量檢測(cè)?；蚪M測(cè)序在上海美吉生物科技有限公司進(jìn)行,測(cè)序平臺(tái)為454 GS-FLX(454 Life Sciences/Roche Diagnostics,CT,USA)。測(cè)序結(jié)束后,對(duì)有效序列進(jìn)行去雜、修剪、去除嵌合體序列等過濾處理,得到優(yōu)化序列。利用Usearch(vsesion 7.1)軟件對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行聚類分析,根據(jù)序列97%的相似性形成操作分類單元(Operational taxonomic units,OUTs),對(duì)比GenBank(http://ncbi.nlm.nih. gov)中的已知序列,得到OTUs的分類學(xué)信息[23]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 2007和SPSS 19.0軟件進(jìn)行計(jì)算和統(tǒng)計(jì)分析,采用配對(duì)t檢驗(yàn)法對(duì)根際和非根際土之間的微生物量碳、氮含量進(jìn)行差異性檢驗(yàn)(P<0.05)。利用16S rDNA序列數(shù)計(jì)算細(xì)菌群落豐富度[24]。

豐富度指數(shù)：

R=Ni/N

式中,N為序列總數(shù),Ni為細(xì)菌i的16S rDNA讀數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤酶活性

由表2可知,在紫莖澤蘭根際,土壤酶活性顯著高于非根際(黃壤和紫色土的過氧化氫酶,以及紫色土的脲酶除外,其增幅未達(dá)顯著水平),依次增加2.74%—62.84%(過氧化氫酶)、7.66%—439.68%(磷酸酶)、2.69%—92.73%(脲酶)和89.18%—562.68%(蔗糖酶)。

表2 紫莖澤蘭根際和非根際土壤的酶活性

表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=5);*表示根際與非根際間差異達(dá)到5%顯著水平(t檢驗(yàn))

2.2 土壤微生物量

配對(duì)t檢驗(yàn)表明,在紫莖澤蘭根際,微生物量碳氮顯著高于非根際(紅壤微生物量氮除外,其增幅未達(dá)顯著水平),微生物量碳分別高于非根際39.60%(紅壤)、47.47%(黃壤)和26.71%(紫色土)；微生物量氮分別高于非根際18.51%(紅壤)、48.13%(黃壤)和59.77%(紫色土)(圖1)。

圖1 紫莖澤蘭土壤中的微生物量碳、氮Fig.1 Microbial biomass carbon and nitrogen in soil with E. adenophorum *表示根際與非根際間差異達(dá)到5%顯著水平,t 檢驗(yàn)

2.3 土壤細(xì)菌

2.3.1 序列數(shù)和分類單元數(shù)

由表3可見,454高通量測(cè)序從3種土壤中獲得21284—39974條16S rDNA序列,分別代表820—1222個(gè)分類單元。配對(duì)t檢驗(yàn)表明,紅壤非根際序列數(shù)顯著高于根際,紫色土根際序列數(shù)顯著高于非根際,而黃壤根際與非根際相似；紅壤根際細(xì)菌分類單元數(shù)顯著低于非根際,黃壤和紫色土根際與非根際相似。

表3 紫莖澤蘭根際和非根際16S rDNA序列數(shù)和分類單元數(shù)

表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=5);*表示根際與非根際間差異達(dá)到5%顯著水平(t檢驗(yàn))

2.3.2 主成分分析

圖2 土壤細(xì)菌群落的主成分變異Fig.2 Principal components variation of soil bacterial community

圖2是土壤細(xì)菌群落的主成分變異情況。其中,PC1和PC2分別表示土壤細(xì)菌群落41.37%和34.47%的變異度。在紅壤和黃壤中,根際細(xì)菌群落的主成分方差和在PC軸上的得分系數(shù)與非根際差異顯著,其坐標(biāo)點(diǎn)處于不同位置,相距較遠(yuǎn)；而紫色土則相反,根際細(xì)菌群落的主成分方差和在PC軸上的得分系數(shù)與非根際無顯著差異,其坐標(biāo)點(diǎn)相距較近。

2.3.3 細(xì)菌門類

由圖3可見,在紫莖澤蘭根際和非根際,細(xì)菌種群歸屬于放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和藍(lán)藻門(Cyanobacteria)等16個(gè)門類。其中,放線菌門、變形菌門和擬桿菌門合占總量的60.69%—78.75%。

在根際和非根際之間,細(xì)菌門類的豐富度因土壤類型和細(xì)菌門類不同而異。從前3種優(yōu)勢(shì)門類看,紅壤的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌依次為放線菌門、擬桿菌門和變形菌門,根際放線菌門的豐富度與非根際相似,變形菌門根際低于非根際,但擬桿菌門則相反；黃壤的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌依次為放線菌門、變形菌門和綠彎菌門,根際放線菌門的豐富度與非根際相似,變形菌門根際低于非根際,但綠彎菌門顯著高于非根際；紫色土根際的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌依次為變形菌門、擬桿菌門和放線菌門,非根際的則是變形菌門、擬桿菌門和酸桿菌門,其中變形菌門顯著高于擬桿菌門,且二者非根際的豐富度均高于根際。

圖3 紫莖澤蘭根際和非根際土壤中的細(xì)菌門類及豐富度Fig.3 Bacterial phyla and abundances in rhizosphere and non-rhizosphere soil of E. adenophorum

2.3.4 優(yōu)勢(shì)類群

由表4可見,在紫莖澤蘭根際和非根際土壤中,前20種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的豐富度合計(jì)占細(xì)菌總量的17.40%—36.57%。在不同土壤之間,20種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌中僅鏈霉菌1(Streptomyces1)為紫莖澤蘭根際的共有細(xì)菌,綠彎菌(Chloroflexi KD4- 96)為非根際共有細(xì)菌。在紅壤中,紫莖澤蘭根際和非根際有11種相同的細(xì)菌,它們是黃桿菌1(Flavobacterium1)、黃桿菌2(Flavobacterium2)、黃桿菌3(Flavobacterium3)、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)、芽生球菌(Blastococcus)、節(jié)桿菌(Arthrobacter)、鏈霉菌1、不可培養(yǎng)鞘脂單胞菌(unculturedKaistobactesp.)、不可培養(yǎng)紅色桿菌(uncultured Solirubrobacterales)、不可培養(yǎng)間孢囊菌(uncultured Intrasporangiaceae)和小單孢菌2(Micromonosporaceae 2)。其中,黃桿菌1、黃桿菌3、黃桿菌2、不可培養(yǎng)鞘脂單胞菌、芽生球菌和不可培養(yǎng)間孢囊菌在根際的豐富度依次高于非根際6.24、4.48、4.41、1.43、1.38、1.11倍；而小單孢菌2、節(jié)桿菌、不可培養(yǎng)紅色桿菌、慢生根瘤菌和鏈霉菌在根際的豐富度則不同程度地低于非根際。在黃壤中,紫莖澤蘭根際和非根際有8種相同的細(xì)菌,分別為慢生根瘤菌、鏈霉菌1、節(jié)桿菌、不可培養(yǎng)鞘脂單胞菌、不可培養(yǎng)生絲微菌(uncultured Hyphomicrobiaceae)、綠彎菌、不可培養(yǎng)間孢囊菌和類諾卡氏菌1(Marmoricola1)。其中,慢生根瘤菌、鏈霉菌1、不可培養(yǎng)生絲微菌和不可培養(yǎng)鞘脂單胞菌在根際的豐富度分別高非根際3.46、1.76、1.58、1.30倍；而綠彎菌、不可培養(yǎng)間孢囊菌、類諾卡氏菌1和節(jié)桿菌在根際的豐富度顯著低于非根際。在紫色土中,紫莖澤蘭根際與非根際有10種相同細(xì)菌,依次為不可培養(yǎng)噬纖維菌(uncultured Cytophagaceae)、不可培養(yǎng)待鑒定菌Latescibacteria、變形菌(Proteobacteria)、不可培養(yǎng)浮霉菌(uncultured Planctomycetes)、綠彎菌、不可培養(yǎng)產(chǎn)堿菌(uncultured Alcaligenaceae)、黃桿菌2、叢毛單胞菌(Comamonadaceae)、黃桿菌(FlavobacteriumenshienseDK69)和黃桿菌3。其中,變形菌和不可培養(yǎng)浮霉菌在根際的豐富度分別高于非根際1.45—1.05倍；但是,不可培養(yǎng)噬纖維菌和不可培養(yǎng)待鑒定菌Latescibacteria在根際和非根際的豐富度無顯著差異,其余菌屬(種)的豐富度根際低于非根際。

3 討論

土壤酶催化土壤生物化學(xué)反應(yīng),與土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化供應(yīng)密切相關(guān)[17]。脲酶水解尿素,提高土壤氮素的生物有效性；蔗糖酶參與蔗糖降解,關(guān)系到土壤有機(jī)質(zhì)礦化；磷酸酶催化有機(jī)磷水解,供植物吸收；過氧化氫酶促進(jìn)過氧化氫分解,涉及到土壤解毒過程[25]。盡管土壤類型不同,但在紫莖澤蘭根際土壤中,上述土壤酶的活性顯著高于非根際,類似李會(huì)娜等和戴蓮等的研究結(jié)果[26- 27],說明在紫莖澤蘭根際,有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化活躍,氮磷有效性較高,有益于增加土壤養(yǎng)分供應(yīng),促進(jìn)植物生長,提高紫莖澤蘭生存競爭能力。此外,紫莖澤蘭根際的微生物量碳氮顯著高于非根際,意味著紫莖澤蘭根系生命活動(dòng)促進(jìn)微生物生長繁殖,數(shù)量增加,活性增強(qiáng),與李會(huì)娜等的研究結(jié)果相似[28],但不同于Sun等的報(bào)道[29]。土壤酶來源于有機(jī)肥、動(dòng)物、植物和微生物等,其中微生物是土壤酶的重要來源之一[30- 31]。因此,在本項(xiàng)研究中,紫莖澤蘭根際微生物量提高,可增加酶分泌量,增強(qiáng)土壤酶活性。

表4 在紫莖澤蘭根際與非根際土壤中,前20種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌的組成與豐富度

紅壤根際的16S rDNA分類單元數(shù)顯著低于非根際,黃壤和紫色土的根際與非根際相似；主成分分析表明,在紅壤和黃壤根際土壤中,細(xì)菌群落的主成分方差和在PC軸上的得分系數(shù)與非根際差異顯著,其坐標(biāo)點(diǎn)處于不同位置,而紫色土根際和非根際則相反。說明紫莖澤蘭對(duì)根際細(xì)菌種群數(shù)量和結(jié)構(gòu)的影響因土壤類型不同而異,對(duì)紅壤和黃壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響較大,但對(duì)紫色土的影響較小。眾所周知,土壤類型不同,微生物種群結(jié)構(gòu)也不一樣[32]。微生物種類不同,對(duì)各類化學(xué)物質(zhì)如抗菌素、重金屬等的敏感性和抗性也存在顯著差異[33- 34]。例如,水稻細(xì)菌性條斑病菌[35]、枯草桿菌[36]對(duì)鏈霉素敏感,但交替單胞菌[37]、酪酸梭菌[38]的敏感性較差；貧營養(yǎng)細(xì)菌[39]、費(fèi)氏弧菌[40]對(duì)重金屬敏感,但弗蘭克氏菌[41]、慢生根瘤菌[42]的敏感性差。紫莖澤蘭根系分泌的化感物質(zhì)內(nèi)含苯、奈、菲、蒽等多環(huán)芳烴等結(jié)構(gòu),故對(duì)根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響表現(xiàn)出土壤類型間的差異和多樣性,由此解釋了前人有關(guān)報(bào)道不盡相同的原因[8, 10, 15],深入研究紫莖澤蘭侵入與不同土壤細(xì)菌群落演變的生理生態(tài)學(xué)意義很有必要。此外,盡管紅壤、黃壤和紫色土的細(xì)菌群落不同,但紫莖澤蘭表現(xiàn)出極強(qiáng)的適應(yīng)性,均可旺盛生長,排除其他植物,形成單優(yōu)種群。

在不同類型土壤之間,優(yōu)勢(shì)菌株的群落結(jié)構(gòu)的差異極大。在根際的20種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌中,僅鏈霉菌1(Streptomyces1)相同,在非根際只有綠彎菌(Chloroflexi KD4- 96)為共有菌株,意味著紫莖澤蘭具有極強(qiáng)的適應(yīng)性,能在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同的土壤上生長。但就同一種土壤而言,紫莖澤蘭根際和非根際細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)門類均為放線菌、變形菌和擬桿菌,合計(jì)占總量的60.69%—78.75%；在前20種優(yōu)勢(shì)細(xì)菌中,根際和非根際之間有8—11株相同,也表現(xiàn)出較高的相似性。說明土壤可能是決定根際微生物種群的重要因素,但因紫莖澤蘭根系生命活動(dòng)而發(fā)生不同程度地變化。此外,放線菌門、變形菌門和擬桿菌門中,很多微生物參與土壤有機(jī)質(zhì)礦化,具有分解纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)和木質(zhì)素等功能[43],加之當(dāng)?shù)貧夂驅(qū)儆跍嘏瘽駶櫟膩啛釒夂?這可能是供試紅壤、黃壤和紫色土有機(jī)質(zhì)含量較低的重要原因之一。

總之,在紫莖澤蘭根際,土壤酶活性及微生物量碳氮含量顯著高于非根際；紫莖澤蘭能在細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)不同的土壤上生長,表現(xiàn)出極強(qiáng)的適應(yīng)性,對(duì)根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響因土壤類型不同而異；土壤是決定細(xì)菌群落的主要因素,但紫莖澤蘭侵入會(huì)導(dǎo)致其發(fā)生一定程度的變化。