高頤雄 趙 勤 譚 信* 張 堅*

（1 中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與健康所 北京100050 2 北京理工大學(xué)生命學(xué)院 北京100081）

骨骼肌萎縮主要表現(xiàn)為骨骼肌質(zhì)量的下降以及骨骼肌力量和功能的減退，它既能增加罹患者跌倒以及跌倒后發(fā)生骨折的概率，又能增加慢性非傳染性疾病患者的死亡率[1]。既往臨床上骨骼肌萎縮常見于慢性非傳染性疾病所致的機體代謝紊亂，如肥胖綜合征，以及糖尿病、慢性腎臟疾病與癌癥惡病質(zhì)等所致的體重下降[2]。近年來，隨我國進入老齡化社會，與年齡增長相關(guān)的肌肉衰減綜合征（sarcopenia）也日益受到關(guān)注[3]。導(dǎo)致骨骼肌萎縮發(fā)生的始動因素目前還不清楚，可能與遺傳因素、機體代謝狀況和慢性非傳染性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。任何導(dǎo)致骨骼肌細胞蛋白分解代謝速率增加并超過合成代謝速率的非正常因素，都可能誘發(fā)骨骼肌萎縮。研究骨骼肌細胞蛋白異常分解的誘因及其抑制途徑，無論從改善骨骼肌萎縮罹患者的生存質(zhì)量，還是從降低社會醫(yī)療負擔(dān)的角度考慮，均具有明確而迫切的實際需要。

n-3 多不飽和脂肪酸（n-3 PUFA）是一類具有多種生理效益的食物成分[4]，其最為熟知的種類是α 亞麻酸（ALA）、二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）。EPA 和DHA 一般被稱為n-3長鏈多不飽和脂肪酸（n-3 LCPUFA），主要來源于海魚等動物性食物[5]，ALA 主要來源于菜籽油和豆油等植物性食物[6]。有研究發(fā)現(xiàn)：不同n-3 PUFA可以通過多種不同途徑刺激胰島素分泌，增加機體胰島素敏感性，并降低骨骼肌細胞內(nèi)有害因素對胰島素/Akt 信號通路活性的抑制[7]，而胰島素/Akt 信號通路的正常運作對于抑制骨骼肌細胞蛋白異常分解發(fā)揮重要作用[8-9]。由此可見，研究n-3 PUFA 調(diào)控骨骼肌組織胰島素/Akt 信號通路的機制，對于探究骨骼肌萎縮的發(fā)生原因與預(yù)防措施，具有重要意義。

1 胰島素/Akt 信號通路抑制骨骼肌細胞蛋白異常分解的機制

在正常情況下，胰島β 細胞分泌的胰島素經(jīng)循環(huán)系統(tǒng)到達骨骼肌組織后，與骨骼肌細胞膜上的胰島素受體α 亞基結(jié)合，引起β 亞基的蛋白酪氨酸激酶活化，繼而磷酸化胰島素受體底物-1（IRS-1）的酪氨酸殘基。IRS-1 被激活后將信號傳導(dǎo)到磷脂酰肌醇3 激酶（PI3K），再經(jīng)一系列下游信號傳導(dǎo)磷酸化蛋白激酶B（Akt）使之激活[10]。激活的Akt 通過抑制叉頭框蛋白O3 轉(zhuǎn)錄因子（Fox-O3 transcription factors）的活化，進而抑制由Fox-O3 表達所介導(dǎo)的肌肉特異E3 泛素連接酶Atrogin-1/MAFbx 和自噬介質(zhì)Binp3 的表達。因為Atrogin-1/MAFbx 表達上調(diào)可激活泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，促進蛋白分解，Binp3 表達上調(diào)可激活自噬溶酶體途徑促進自噬作用，所以維持胰島素/Akt信號通路的活性被認為可以抑制骨骼肌細胞內(nèi)蛋白的異常分解[8-9]。當(dāng)胰島素分泌不足和/或有害因素導(dǎo)致的包括Akt 活性減弱在內(nèi)的胰島素抵抗發(fā)生時，均可引發(fā)一系列骨骼肌細胞內(nèi)下游信號通路的改變，啟動泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬溶酶體途徑并最終導(dǎo)致骨骼肌細胞蛋白的異常分解[11]。胰島素分泌不足以及胰島素利用能力下降常見于糖尿病等機體代謝紊亂?？蓪?dǎo)致骨骼肌細胞內(nèi)Akt 活性減弱的有害因素主要包括過量的炎性細胞因子與飽和脂肪酸（SFA）。

炎性細胞因子（如IL-6 與TNF-α）介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和飽和脂肪酸的脂毒性代謝產(chǎn)物對骨骼肌細胞的胰島素/Akt 信號通路的有害影響往往互為因果，共同導(dǎo)致通路抑制[12]。SFA 的代謝產(chǎn)物，如甘油二酯和神經(jīng)酰胺等，對骨骼肌細胞的脂毒性作用的主要機理即抑制胰島素/Akt 信號通路的活性[13]。這些分子可以介導(dǎo)核因子κb（NF-κb）以及多種炎性細胞因子（如TNF-α 和IL-6）的激活與表達，繼而通過多種途徑導(dǎo)致胰島素/Akt 信號通路異常，例如：1） 活化的NF-κb 可以通過活化IKK 使IRS-1 的絲氨酸殘基磷酸化，從而抑制胰島素/Akt 信號通路上的重要信號分子PI3K 的活化，并可啟動炎性細胞因子（TNF-α 和IL-6）基因的轉(zhuǎn)錄；2） 炎性細胞因子的表達上調(diào)同樣具有進一步活化NF-κb 的作用，并且可以降低骨骼肌細胞IRS-1 的酪氨酸磷酸化和增加其絲氨酸磷酸化，這一磷酸化比例的改變既能導(dǎo)致IRS-1 被泛素化/蛋白酶體降解增加，又能降低IRS-1 與PI3K的p85 亞基結(jié)合的能力。炎性細胞因子TNF-α 通過骨骼肌細胞的TNF 受體1 上調(diào)蛋白磷酸酶2C的表達，繼而降低乙酰輔酶A 羧化酶磷酸化，抑制飽和脂肪酸的氧化分解，增加其在骨骼肌細胞內(nèi)脂毒性代謝產(chǎn)物的蓄積，形成惡性循環(huán)[13-14]。

簡而言之，骨骼肌細胞內(nèi)蛋白的異常分解，特別是泛素-蛋白酶體與自噬溶酶體途徑的異常激活，在骨骼肌組織萎縮發(fā)生、發(fā)展進程中扮演了重要的角色。胰島素/Akt 信號通路的正常運作有助于抑制上述途徑的異常激活。研究并闡明包括膳食在內(nèi)的多種可以維持胰島素/Akt 信號通路正?；钚缘母深A(yù)手段及其機制，將有助于對抗骨骼肌萎縮的發(fā)生及其對罹患者所造成的不良影響。

2 n-3 PUFA 對胰島素分泌及胰島素敏感性提高的促進作用

2.1 n-3 PUFA 促進胰島素分泌的直接/間接途徑

以含有ALA（500μmol/L）的培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠源胰島β 細胞（INS-1），結(jié)果顯示：48h 后ALA 干預(yù)組的基礎(chǔ)胰島素分泌量與葡萄糖刺激的胰島素分泌量均顯著高于棕櫚酸（PA）、油酸（OA）和亞油酸（LA）干預(yù)組（P＜0.05）。ALA 干預(yù)組的G 蛋白偶聯(lián)受體40（GPR40）的mRNA 表達顯著高于對照組（P＜0.01）以及OA 和LA 干預(yù)組（P＜0.05），而OA 和LA 干預(yù)組則與對照組無顯著差異（P＞0.05）。GPR40 蛋白的表達結(jié)果與其mRNA 表達結(jié)果類似[15]。這一研究提示：ALA 促進胰島β 細胞分泌胰島素可能是通過直接活化胰島β 細胞膜的GPR40達到的。

ALA 間接促進胰島素分泌的途徑同樣與GPR40 有關(guān)，即：ALA 與腸內(nèi)分泌細胞胞膜的GPR40 結(jié)合后，可促進腸內(nèi)分泌細胞分泌胰高血糖素樣肽-1（GLP-1），進而發(fā)揮腸促胰島素效應(yīng)[16]。EPA 與DHA 這兩種n-3 LCPUFA 則可與腸內(nèi)分泌細胞胞膜的GPR120 結(jié)合，進而刺激GLP-1 的分泌[17]。此外，EPA 與DHA 還可通過下調(diào)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c（SREBP-1c）的表達改善體內(nèi)脂質(zhì)代謝環(huán)境，從而間接促進胰島素分泌[18-19]。

2.2 n-3 PUFA 對細胞胰島素敏感性的影響

ALA 提高胰島素敏感性的能力主要是通過促進胰島素樣生長因子-1 （IGF-1） 的分泌實現(xiàn)[20]。IGF-1 對骨骼肌細胞膜IGF-1 受體 （IGF-1R）及胰島素受體均具有親合性，與這些受體結(jié)合后可發(fā)揮胰島素樣活性，繼而激活下游PI3K、Akt 等信號分子，結(jié)果表現(xiàn)為胰島素敏感性的提高[21-22]。與ALA 相比，EPA 與DHA 間接促進胰島素敏感性的途徑更為豐富，主要包括：1）EPA 與DHA 通過維持Iκb 的活性，從而抑制NF-κb 的活化，繼而抑制NF-κb 信號通路的激活和炎性細胞因子（TNFα 和IL-6）的表達，達到提高胰島素敏感性的目的[23-24]；2）EPA 促進IGF-1 和愛帕琳肽（apelin）的分泌[25-26]，以及DHA 促進IL-10 的分泌[24]，均有助于骨骼肌細胞胰島素敏感性的增加。

3 n-3 PUFA 維持骨骼肌細胞內(nèi)Akt 活性抑制蛋白異常分解的研究

Bryner 等[27]以小鼠C2C12 肌管細胞為研究對象，分別用PA（0.5 mmol/L）與DHA（0.1 mmol/L）處理，96h 后PA 處理組的肌管直徑與空白對照組相比下降90%（P＜0.001），而DHA 處理組與PA+DHA 處理組96 h 后與空白對照組相比均上升約10%（P＜0.05）。以胰島素 （100 nmol/L） 處理15 min，Western blot 檢測結(jié)果顯示，PA 處理組磷酸化Akt（p-Akt）的表達僅為空白組、PA+DHA 處理組和DHA 處理組的50%，總Akt 的表達僅為25%～45%（P＜0.02），PA+DHA 處理組和DHA 處理組與空白組相比Akt 表達均無統(tǒng)計學(xué)差異[27]。另一項同樣以C2C12 肌管細胞為研究對象的類似研究進一步表明，以PA （500 μmol/L） 和/或DHA（100 μmol/L）處理，28h 后棕櫚酸處理組的C2C12細胞蛋白降解比空白組上升31%（P＜0.01），而PA+DHA 處理組與空白組相比無統(tǒng)計學(xué)差異；實時定量PCR（real-time qPCR）檢測結(jié)果顯示，PA處理組E3 泛素連接酶Atrogin-1/MAFbx 的mRNA（處理4h） 和自噬介質(zhì)Binp3 的mRNA （處理24h）與空白組相比均顯著上升（P＜0.01），PA+DHA處理組與空白組相比無統(tǒng)計學(xué)差異；Western blot檢測結(jié)果顯示，從開始處理后2h 起至24h，PA 處理組的Akt473 號位的絲氨酸的磷酸化持續(xù)被抑制，而PA+DHA 處理組從處理后4h 起Akt 的磷酸化恢復(fù)至空白對照組水平；與空白組相比，DHA干預(yù)（24 h）可以顯著降低自噬相關(guān)蛋白LC3B-II的表達水平（P＜0.05），這一降低與PA 是否存在無關(guān)[28]。上述研究表明飽和脂肪酸（PA）及其細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物的脂毒性可以通過抑制胰島素/Akt 信號通路活性而導(dǎo)致骨骼肌細胞蛋白異常分解，分解的具體途徑與泛素-蛋白酶體系統(tǒng)和自噬溶酶體途徑的激活有關(guān)，而DHA 有助于抑制上述途徑的激活并抑制其所造成的有害效應(yīng)。

ALA（50 μmol/L）同樣可抑制C2C12 肌管細胞中PA（500 μmol/L）介導(dǎo)的甘油二酯與神經(jīng)酰胺的合成，然而該濃度ALA 無法促進骨骼肌細胞中PA 的β 氧化分解，也無法解除PA 對于Akt 活化的抑制效應(yīng)。EPA（50 μmol/L）和DHA（50 μmol/L）則具有這些能力。這提示：ALA 至少在較低濃度時可能不具有維持骨骼肌細胞Akt 活性的能力[29]。

4 對已有研究的總結(jié)與展望

雖然上述研究表明n-3 LCPUFA 具有抑制骨骼肌細胞蛋白異常分解的效果[27-28]，但是以下兩個問題的存在仍不容忽視：1）n-3 LCPUFA 主要存在于海魚類食物中，而增加魚類食物的消費量與我國大部分居民的傳統(tǒng)膳食模式并不相符，民眾較難接受。例如，全國營養(yǎng)狀況監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示：2012年我國居民魚蝦類食物消費量僅為平均23.7 g/（標準人·d），而且這一數(shù)據(jù)較2002年的數(shù)據(jù)平均29.6 g/（標準人·d）還有所下降[30]；2）增加海魚類食物的消費量同樣可能導(dǎo)致消費者特定種類污染物的暴露劑量上升，繼而導(dǎo)致其他方面的健康風(fēng)險增加，如甲基汞所致的胎兒/新生兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育損害和二噁英類化合物所致一般人群的癌癥罹患風(fēng)險上升[31-32]。

既往觀點認為ALA 等植物來源n-3 PUFA的生理效益主要是通過內(nèi)源合成途徑產(chǎn)生n-3 LCPUFA，以彌補其直接攝入的不足。隨著研究的不斷深入，植物來源n-3 PUFA 具有獨特的生理效益，這一觀點正成為共識。如前所述，盡管ALA在骨骼肌細胞內(nèi)可能不具有維持Akt 活性的能力，但是其具有促進胰島素分泌與增加胰島素敏感性的能力，且發(fā)揮這些能力的機制與EPA 和DHA 也不盡相同。此外，更加值得重視的一個實際情況是：我國居民植物油的消費量近年來穩(wěn)步增加，從2002年的32.9 g/（標準人·d）增至2012年的37.3 g/（標準人·d）[30]，而ALA 主要就存在于我國居民消費量較大的部分種類的植物油，比如菜籽油和豆油中[6]。上述研究與調(diào)查結(jié)果提示，對植物來源n-3 PUFA 生理效益的研究，應(yīng)該給予像n-3 LCPUFA 一樣的關(guān)注程度，這不僅與我國居民的膳食模式更加契合，也有助于降低膳食n-3 PUFA 由單一種類食物資源提供而可能導(dǎo)致的食品安全隱患。

ALA、EPA、DHA 在碳鏈長度與不飽和程度上存在遞增關(guān)系，它們在維持胰島素/Akt 信號通路及由此抑制骨骼肌細胞蛋白異常分解的能力上各有側(cè)重，這提示碳鏈長度與不飽和程度介乎于它們之間的其它n-3 PUFA 可能兼有它們的效能，比如十八碳四烯酸（SDA）。這種n-3 PUFA 在自然界主要發(fā)現(xiàn)于紫草科 （Boraginaceae） 藍薊屬（Echium）植物的種子中，由其提煉的食用藍薊籽油中SDA 含量可超過10%。近年來，隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)逐漸應(yīng)用于農(nóng)業(yè)，商品化的富含SDA 的轉(zhuǎn)基因大豆油中SDA 的含量可達20%以上[33]。由于上述植物性食物資源的開發(fā)，SDA 于近年逐漸受到關(guān)注。目前為止，關(guān)于SDA 內(nèi)源轉(zhuǎn)化之外的生理效益的報道仍較為有限，例如有報道指出SDA 干預(yù)與CD95 介導(dǎo)的人乳腺癌細胞凋亡間存在關(guān)聯(lián)[34]。然而，SDA 是否能通過胰島素/Akt 信號通路影響骨骼肌細胞尚未見報道。可以預(yù)見，針對包括SDA 在內(nèi)的n-3 PUFA 的持續(xù)研究，將會進一步拓展與深化人們對n-3 PUFA 作用于胰島素/Akt信號通路，繼而抑制骨骼肌細胞蛋白異常分解的認識，并為通過膳食手段預(yù)防生理與病理性骨骼肌萎縮提供新的思路。