李彥瑩，朱新焰，石亞娜，楊發(fā)建，季鵬章*，王家金

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，云南 昆明 650223；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所，云南 昆明 650092；3.保山中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，云南 保山 678000)

【研究意義】黃精是百合科多年生草本植物[1]，已有2000多年藥用歷史[2]，被廣泛的應(yīng)用在日常生活中，目前已有150余種中成藥和170余種保健品以黃精作為原料進(jìn)行生產(chǎn)加工[3]。據(jù)《云南省人民政府關(guān)于加快中藥(民族藥)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的指導(dǎo)意見》指出，要加快發(fā)展石斛、燈盞花、血竭、銀杏、滇黃精等優(yōu)勢(shì)特色藥材，預(yù)計(jì)到2020年，云南省中藥(民族藥)總產(chǎn)值達(dá)到1400億元，滇黃精作為黃精的基原植物之一[4]，具有巨大的市場(chǎng)潛力?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】滇黃精既是云南道地藥材，又是藥食同源的植物[5]。多糖作為黃精主要藥理活性成分[6]被廣泛關(guān)注，但作為植物多糖類的淀粉在滇黃精中還未有研究，王慶南[7]認(rèn)為甘薯的理化特性與口感品質(zhì)有一定關(guān)聯(lián)性，劉文靜[8]研究發(fā)現(xiàn)淀粉與甘薯口感呈正相關(guān)關(guān)系，因此滇黃精作為一種藥食同源植物對(duì)其淀粉含量測(cè)定方法進(jìn)行研究極有必要?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對(duì)淀粉含量的測(cè)定有苯酚硫酸法、DNS法、還原糖測(cè)定儀法、高氯酸法、碘顯色法、近紅外光譜法、酶解蒽酮比色法[9-12]等方法，常見于玉米、煙葉、稻米、甘薯、蓮藕、馬鈴薯[9-14]等植物的淀粉測(cè)定研究，目前沒有針對(duì)滇黃精淀粉含量的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)旨在對(duì)GB5009.9-2016中酶水解法測(cè)定工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到酶水解測(cè)定滇黃精淀粉含量的最佳工藝，以期為滇黃精淀粉的后續(xù)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

滇黃精干燥塊莖，采于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所滇源基地，經(jīng)季鵬章研究員鑒定為百合科植物滇黃精(Polygonatumkingianum)。高峰α-淀粉酶 Solarbio科技有限公司，活性40 000 U/g；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-S28型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；CP153型分析天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；XM-2500Y型多功能粉碎機(jī)(永康市鉑歐五金制品有限公司)；DK-98-I型電爐(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 提取液制備 干燥塊莖→粉碎(過(guò)50目篩)→脫脂→脫糖→糊化(沸水浴15 min)→冷卻→淀粉酶酶解(57 ℃、1 h)→滅酶→定容→過(guò)濾→酸水解(沸水，55 min)→冷卻調(diào)pH(NaOH)→定容。

1.3.2 淀粉含量測(cè)定 酶水解法(GB 5009.9-2016)。

1.3.3 滇黃精淀粉含量計(jì)算

(1)

(2)

(3)

式中,X1為所稱試樣中葡萄糖的質(zhì)量，單位為mg；m2為標(biāo)定10 mL堿性酒石酸銅溶液時(shí)消耗的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積與加入試樣后消耗的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積之差，為葡萄糖的質(zhì)量，單位mg；m1為10 mL堿性酒石酸銅溶液相當(dāng)于葡萄糖的質(zhì)量，單位為mg；V1為標(biāo)定堿性酒石酸銅溶液時(shí)消耗的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積；V2為加入試樣后消耗的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液體積；X為試樣淀粉含量，單位為g/100g；X0為試劑空白值，單位mg；m為試樣質(zhì)量，單位g。

表1脫糖次數(shù)對(duì)滇黃精淀粉含量測(cè)定的影響

Table 1 The effect of desugar times on the determination of starch content of Dianhuangjing

脫糖次數(shù)The desugar times淀粉含量(g/100g)The content of starch相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)Relative standard deviation43.432.3253.172.0463.111.8773.071.8883.041.79

1.3.4 單因素試驗(yàn) 分別以脫糖次數(shù)(4、5、6、7、8次)、酶解溫度(51、53、55、57、59 ℃)、加酶量(15、20、25、30、35 mL)、酸水解時(shí)間(50、55、60、65、70 min)進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.3.5 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以淀粉含量為考察指標(biāo)，對(duì)脫糖次數(shù)、酶解溫度、加酶量、酸水解時(shí)間進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，得出最佳測(cè)定提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 脫糖次數(shù)對(duì)滇黃精淀粉含量測(cè)定的影響 在酶解溫度55 ℃、加酶量20 mL、酸水解時(shí)間60 min的條件下，分別進(jìn)行4、5、6、7、8次脫糖，測(cè)得結(jié)果如表1所示。隨著脫糖次數(shù)的增加，淀粉含量逐漸減少，當(dāng)脫糖次數(shù)大于6次時(shí)，測(cè)定結(jié)果趨于穩(wěn)定，可能是滇黃精中的可溶性糖已經(jīng)大致去除。所以確定6次為最佳脫糖次數(shù)。

2.1.2 酶解溫度對(duì)滇黃精淀粉含量測(cè)定的影響 表2所示，脫糖次數(shù)為6次，其他條件與2.1.1一致，滇黃精淀粉含量差距不明顯，但酶解溫度高于55 ℃誤差較穩(wěn)定，低于55 ℃可能由于溫度較低，酶解過(guò)程不穩(wěn)定?？紤]到溫度保持的準(zhǔn)確程度，確定57℃為最佳酶解溫度。

2.1.3 加酶量對(duì)滇黃精淀粉含量測(cè)定的影響 表3所示，酶解溫度57 ℃，其他條件與2.1.2一致，滇黃精淀粉含量大于20 mL加酶量基本趨于穩(wěn)定，無(wú)明顯變化，說(shuō)明當(dāng)加酶量達(dá)到一定值后達(dá)到飽和，但相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差隨加酶量增加而逐漸增大，可能飽和后多余的酶液對(duì)后續(xù)的測(cè)定造成影響。所以確定20 mL為最佳加酶量。

表2酶解溫度對(duì)滇黃精淀粉含量測(cè)定的影響

Table 2 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on the determination of starch content of Dianhuangjing

酶解溫度(℃)Enzymatic hydrolysis temperature淀粉含量(g/100g)The content of starch相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)Relative standard deviation513.082.56533.092.47553.072.12573.081.87593.111.75

表3加酶量對(duì)滇黃精淀粉含量測(cè)定的影響

Table 3 The effect of enzyme concentration on the determination of starch content of Dianhuangjing

加酶量(mL)Enzyme concentration淀粉含量(g/100g)The content of starch相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)Relative standard deviation153.141.61203.151.74253.182.38303.172.41353.172.55

2.1.4 酸水解時(shí)間對(duì)滇黃精淀粉含量測(cè)定的影響 表4所示，加酶量20 mL，其他條件同2.1.3，隨著酸水解時(shí)間的延長(zhǎng)，滇黃精淀粉含量不斷增加，在60 min時(shí)漲幅最大，之后漲幅減小，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在60 min內(nèi)較小，超過(guò)60 min可能水解出其他糖類物質(zhì)，所以酸水解60 min為最佳時(shí)間。

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以脫糖次數(shù)、酶解溫度、加酶量和酸水解時(shí)間為正交試驗(yàn)因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3個(gè)水平，因素和水平、結(jié)果見表5。極差分析可知，各影響因素對(duì)測(cè)定滇黃精淀粉含量的影響程度依次為加酶量﹥酸水解時(shí)間﹥脫糖次數(shù)﹥酶解溫度，酶水解法測(cè)定滇黃精淀粉含量的最佳工藝條件為A1B2C1D3，既脫糖次數(shù)為5次、酶解溫度為57 ℃、加酶量15 mL(5 g/L)、酸水解65 min。

表4酸水解時(shí)間對(duì)滇黃精淀粉含量測(cè)定的影響

Table 4 The effect of acid hydrolysis time on the determination of starch content of Dianhuangjing

酸水解時(shí)間(min)Acid hydrolysis time淀粉含量(g/100g)The content of starch相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(%)RSD502.882.13553.092.52603.281.67653.432.43703.462.79

如表6所示，加酶量對(duì)滇黃精淀粉含量影響顯著，脫糖次數(shù)、酶解溫度和酸水解時(shí)間不顯著，說(shuō)明加酶量是一個(gè)重要因素，根據(jù)表5結(jié)果結(jié)合現(xiàn)實(shí)操作成本，最佳工藝定為A1B2C1D1，即脫糖次數(shù)為5次、酶解溫度為57 ℃、加酶量15 mL(5 g/L)、酸水解55 min。

3 討 論

脫糖次數(shù)對(duì)淀粉含量沒有顯著影響，可能滇黃精中可溶性糖含量不高。酸水解時(shí)間對(duì)滇黃精淀粉含量測(cè)定影響不顯著，可能與單因素試驗(yàn)的溫度范圍跨度太大有關(guān)，而正交試驗(yàn)的時(shí)間跨度太小導(dǎo)致不顯著(Sig值>0.05)。酶解溫度對(duì)滇黃精淀粉含量測(cè)定影響不明顯，可能與酶解溫度只影響樣品液提取的前一部分而對(duì)過(guò)濾后酸水解部分影響不大有關(guān)，故以后可采取分段正交優(yōu)化試驗(yàn)研究滇黃精淀粉含量測(cè)定條件。

表5 酶水解法測(cè)定滇黃精淀粉含量正交優(yōu)化試驗(yàn)

表6 方差分析

注：**表示差異極顯著(Sig<0.01)；*表示差異顯著(Sig<0.05)。

Notes: ** indicated particularly significant difference (Sig<0.01); * indicated significant difference (Sig<0.05).

目前還沒有對(duì)滇黃精的淀粉種類及結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行相關(guān)研究，不能確定某部分操作工藝條件是否會(huì)對(duì)滇黃精淀粉含量測(cè)定具有顯著影響。Mehrnoush Amid[15]研究，紅龍果皮中的淀粉酶具有很好的熱穩(wěn)定性，溫度對(duì)紅龍果淀粉酶影響不大，而Ornanong S. Kittipongpatana[16]研究，菠蘿蜜種子中的抗性淀粉受水分和溫度影響，與處理時(shí)間影響不大；當(dāng)高靜水壓與α-淀粉酶同時(shí)作用，酶濃度越高，淀粉溶解度越高[17]。上述研究在沒有了解滇黃精淀粉種類和比例結(jié)構(gòu)前不具有參考意義，下一步應(yīng)該從滇黃精的淀粉種類和含量結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，以期明確滇黃精淀粉含量測(cè)定工藝過(guò)程和起顯著影響作用的因素。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，各條件因素對(duì)酶水解法測(cè)定滇黃精淀粉含量的影響程度依次為加酶量﹥酸水解時(shí)間﹥脫糖次數(shù)﹥酶解溫度。其中，加酶量對(duì)滇黃精淀粉含量影響顯著，其余條件不顯著。酶水解法測(cè)定滇黃精淀粉含量的最佳工藝條件為脫糖次數(shù)為5次、酶解溫度為57 ℃、加酶量15 mL(5 g/L)、酸水解55 min。