孫艷菲， 陳 瑞,2， 王 露， 江 睿， 鄧 淳， 胡 源,2， 饒勝其,2，*

(1.揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院， 江蘇 揚(yáng)州 225127；2.江蘇省乳品生物技術(shù)與安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 揚(yáng)州 225127)

益生菌(probiotics)又稱(chēng)微生態(tài)調(diào)節(jié)劑、活菌制劑，是一類(lèi)能夠?qū)λ拗魃砉δ墚a(chǎn)生有益作用的活性微生物，具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、改善腸道內(nèi)環(huán)境、調(diào)節(jié)腸道菌群、抑制致病性菌等作用，主要包括雙歧桿菌、乳酸菌和酵母菌[1-2]。戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)隸屬鏈球菌科片球菌屬，為革蘭氏陽(yáng)性菌，因其能發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸而屬于乳酸菌的一種。戊糖片球菌廣泛分布于泡菜、干酪、香腸等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中，對(duì)提高發(fā)酵食品的風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)及安全性具有重要作用，同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)健康以及抵抗病原菌侵襲等多種益生功能[3-4]。

乳酸菌的多種益生功能與其表面活性因子的存在密不可分。黏附是乳酸菌發(fā)揮益生作用的第一步，乳酸菌依靠其表面的蛋白、多糖等黏附宿主腸上皮細(xì)胞并定植，分泌代謝產(chǎn)物等，進(jìn)而發(fā)揮抑制致病菌黏附和抑制致病菌生長(zhǎng)等重要生理作用。在乳酸菌表面的眾多黏附因子當(dāng)中，乳酸菌表面蛋白是其主要黏附因子，與黏附相關(guān)的表面蛋白主要包括s-層蛋白、引物酶Sortase依賴(lài)蛋白、黏膜結(jié)合蛋白、黏附胞外間質(zhì)的表面蛋白等[5-6]。目前有關(guān)乳酸菌表面蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究主要集中在乳酸桿菌中，包括羅伊氏乳桿菌的黏液結(jié)合蛋白(Mub)[7]、卷曲乳桿菌的膠原結(jié)合表層蛋白(CbsA)[8]和S-層蛋白(Slp B)[9]、植物乳桿菌NL42 的細(xì)胞壁固定蛋白(CwaA)[10]等， 而有關(guān)乳酸球菌表面蛋白的研究報(bào)道相對(duì)較少。

本研究室前期從臭豆腐發(fā)酵鹵水中篩選到一株高黏附性戊糖片球菌F28-8，為進(jìn)一步探究其益生功能，通過(guò)LiCl提取其表面蛋白，研究其對(duì)菌株表面性質(zhì)的影響；同時(shí)研究其對(duì)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌黏附膠原蛋白的抑制作用以及抑菌作用，希望為戊糖片球菌及其表面蛋白在食品、生物和醫(yī)藥領(lǐng)域的實(shí)際應(yīng)用提供信息參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

P.pentosaceusF28-8，揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院食品微生物實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)利保藏菌株(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.9956)；StaphylococcusaureusCICC 21600、Salmonellaentericasubsp. CICC 21513(低毒力)，購(gòu)置于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

LB液體培養(yǎng)基的配制：胰蛋白胨10 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1、氯化鈉10 g·L-1、蒸餾水1 L，121 ℃濕熱滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋，日本Tommy公司；Tecnai-12型透射電鏡，荷蘭Phlilps公司；ALPHAI-2LD PLUS型冷凍干燥機(jī)，德國(guó) Christ 公司；5800型超高分辨飛行時(shí)間生物質(zhì)譜儀，美國(guó) AB SCIEX公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1菌株活化

取-20 ℃甘油管保存的戊糖片球菌按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)20 h后，再按2%的接種量活化于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)20 h，備用。

取-20 ℃甘油管保存的金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌按體積分?jǐn)?shù)2%的接種量接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)14 h后，再按2%的接種量活化于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)14 h，備用。

1.3.2戊糖片球菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸能力測(cè)定

以2%接種量取-70 ℃甘油貯存液接種于MRS培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，每隔2 h測(cè)其OD600值與pH值并繪制生長(zhǎng)情況與產(chǎn)酸能力曲線圖。

1.3.3戊糖片球菌表面蛋白的提取與分析

表面蛋白提取方法參考Johnson-Henry等[11]的研究并稍作修改。菌株接種MRS培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，8 000 r/min離心收集菌體，PBS洗滌2次離心。對(duì)照組將菌體重懸于PBS(phosphate buffered saline)，處理組菌體加5 mol/L，LiCl 37 ℃作用0.5 h，離心(8 000 r/min，15 min) ，棄上清液，4 mol/L鹽酸胍溶液重懸混勻，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中處理1 h，離心(8 000 r/min，15 min)，收集上清液。將上清液移入14 kDa分子截留量的透析袋中，4 ℃去離子水中透析48 h后，離心(12 000r/min，15 min)取上清液，即為戊糖片球菌表面蛋白。

將LiCl處理前后的菌體重懸于PBS，分別滴至專(zhuān)用銅網(wǎng)上，自然晾干10 min后，滴加體積分?jǐn)?shù)為2%的磷鎢酸染色2 min，濾紙吸除多余染液，用燈烘干。將樣品裝入樣品臺(tái)，放入樣品室進(jìn)行透射電子顯微鏡(TEM)觀察。同時(shí)將LiCl提取物采用12%分離膠的SDS-PAGE進(jìn)行電泳分析。將電泳膠上的條帶進(jìn)行割膠后，采用PBS洗凈，經(jīng)胰蛋白酶酶解后進(jìn)行MALDI-TOF-MS質(zhì)譜分析，并應(yīng)用MASCOT軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)以獲得蛋白信息。

1.3.4戊糖片球菌表面性質(zhì)測(cè)定

1.3.4.1 表面疏水性測(cè)定

參考Rahman等[12]的方法并加以適當(dāng)修改。采用0.1 mol/L KNO3溶液(pH值6.2)調(diào)整戊糖片球菌懸液菌體濃度至約108CFU/mL，記錄其OD600值為A0。取1 mL二甲苯加到3 mL戊糖片球菌懸液中，室溫靜置10 min后振蕩2 min，再靜置20 min。取水相測(cè)定其OD600值記為A1，KNO3溶液為空白對(duì)照。表面疏水率計(jì)算公式為(1-A1/A0)×100%，公式中A1代表二甲苯處理后戊糖片球菌懸液在600 nm波長(zhǎng)下的吸光值，A0代表二甲苯處理前戊糖片球菌懸液在600 nm波長(zhǎng)下的吸光值。對(duì)照組為未經(jīng)LiCl處理的乳桿菌，處理組為經(jīng)過(guò)LiCl處理的乳桿菌。

1.3.4.2 自動(dòng)聚集能力測(cè)定

參考楊振泉等[4]的方法加以適當(dāng)修改。戊糖片球菌懸液用PBS調(diào)整菌體濃度至約108CFU/mL。菌懸液混勻10 s后，記錄其OD600為A0。室溫靜置4 h，取上清液測(cè)定其OD600為A4，PBS溶液作為空白對(duì)照。自動(dòng)聚集率計(jì)算公式為(1-A4/A0)×100%，公式中A4代表戊糖片球菌菌懸液靜置4 h后在600 nm波長(zhǎng)下的吸光值，A0代表初始戊糖片球菌懸液在600 nm波長(zhǎng)下吸光值。對(duì)照組為未經(jīng)LiCl處理的乳桿菌，處理組為經(jīng)過(guò)LiCl處理的乳桿菌。

1.3.4.3 表面電荷測(cè)定

表面電荷測(cè)定，參考Kos等[13]的研究方法，稍作修改。取1 mL三氯甲烷或乙酸乙酯加到3 mL戊糖片球菌懸液中，室溫靜置10 min后振蕩2 min，再靜置20 min。取水相測(cè)定其OD600值記為A1， KNO3溶液為空白對(duì)照。溶劑吸附率計(jì)算公式為(1-A1/A0)×100%。公式中A1代表三氯甲烷或乙酸乙酯處理后的菌懸液在600 nm波長(zhǎng)下的吸光值，A0代表三氯甲烷或乙酸乙酯處理前菌懸液在600 nm波長(zhǎng)下的吸光值。對(duì)照組為未經(jīng)LiCl處理的乳桿菌，處理組為經(jīng)過(guò)LiCl處理的乳桿菌。

1.3.5菌株細(xì)胞黏附能力測(cè)定

參考Horie等[14]實(shí)驗(yàn)方法并做適當(dāng)修改。將玻片置于12孔培養(yǎng)板，每孔加入膠原蛋白液(25 μg/mL)2 mL，室溫下包被12 h。棄去蛋白液，無(wú)菌PBS(pH值7.2)洗滌3次。分別加入2 mL1.3.3中LiCl處理前后的戊糖片球菌F28-8菌懸液(108CPU/mL)，放在37 ℃培養(yǎng)箱孵育3 h，每組做兩個(gè)復(fù)孔。棄去未黏附乳桿菌菌體后，用無(wú)菌PBS沖洗3次，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%甲醇固定5 min左右，用結(jié)晶紫染色2 min后洗滌脫色烘干。使用光學(xué)顯微鏡，于10×100倍油鏡下觀察，隨機(jī)挑選10個(gè)視野，計(jì)算玻片表面黏附的戊糖片球菌數(shù)量并取3次實(shí)驗(yàn)的平均值表示菌體的黏附能力。

待膠原蛋白貼壁完全后，于培養(yǎng)板中加入2 mL1.3.3中提取的表面蛋白(100 μg/mL)，37 ℃孵育3 h。吸掉未結(jié)合的蛋白，無(wú)菌PBS洗滌3次。加入2 mLStaphylococcusaureusCICC 21600、或Salmonellaentericasubsp. CICC 21513(108CFU/mL)，放在37 ℃培養(yǎng)箱孵育3 h，每組做兩個(gè)復(fù)孔。棄去未黏附菌體細(xì)胞后，進(jìn)一步采用甲醇固定、結(jié)晶紫染色和顯微鏡觀察，計(jì)算玻片表面黏附的菌體細(xì)胞數(shù)量。

1.3.6戊糖片球菌表面蛋白抑菌能力測(cè)定

參照Pradoacosta等[15]的研究方法加以修改。取活化好的S.aureusCICC 21600和S.entericasubsp. CICC 21513菌懸液接種入LB液體培養(yǎng)基中，接種量(體積分?jǐn)?shù))為2%。實(shí)驗(yàn)組同時(shí)加入戊糖片球菌表面蛋白(終質(zhì)量濃度為10 μg/mL)，而對(duì)照組只接種S.aureusCICC 21600和S.entericasubsp. CICC 21513，37 ℃搖床振蕩培養(yǎng)10 h，每2 h測(cè)一次OD600值。繪制生長(zhǎng)曲線圖。同一培養(yǎng)時(shí)間，實(shí)驗(yàn)組的吸光度值記為AT，對(duì)照組的吸光度值記為AC，按照式(1)計(jì)算S.aureusCICC 21600和S.entericasubsp. CICC 21513的生長(zhǎng)抑制率。

(1)

1.3.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan’s多重分析進(jìn)行組間顯著性檢驗(yàn)，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 戊糖片球菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酸情況分析

將活化好的戊糖片球菌培養(yǎng)液接種至MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，每2 h測(cè)一次OD600值，繪制一定培養(yǎng)條件下戊糖片球菌的生長(zhǎng)曲線圖，如圖1。圖1中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，戊糖片球菌的生長(zhǎng)速度逐步增快，并在4 h左右開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)12 h后達(dá)到穩(wěn)定期，生長(zhǎng)減緩。在戊糖片球菌的適應(yīng)期和對(duì)數(shù)期，培養(yǎng)基中的pH值一直在下降，從5.64下降到4.14，并在12 h趨于穩(wěn)定。在酸性條件下仍然保持生長(zhǎng)穩(wěn)定，說(shuō)明戊糖片球菌具有較強(qiáng)的酸適應(yīng)能力，能夠在較低pH值條件下存活。

圖1 P. pentosaceus F28-8的生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸情況Fig.1 Growth curve and acid production of P. pentosaceus F28-8

2.2 戊糖片球菌表面蛋白的提取及鑒定結(jié)果

戊糖片球菌F28-8在37 ℃恒溫培養(yǎng)18 h后，透射電鏡結(jié)果，見(jiàn)圖2。圖2(a)顯示分離株的細(xì)胞形態(tài)為四聯(lián)球，并存在表層結(jié)構(gòu)(圖2(a))，經(jīng)LiCl處理之后，菌株表層基本脫落(圖2(b))。對(duì)LiCl提取的表面蛋白進(jìn)行了電泳分析，如圖3。圖3中，戊糖片球菌的LiCl提取物在分子量45～116 kDa存在主要蛋白條帶a和b。

將條帶a和b分別進(jìn)行割膠回收，膠內(nèi)酶解，利用MALDI-TOF-MS進(jìn)行蛋白鑒定，條帶a的一級(jí)質(zhì)譜圖及代表母離子1 567.79 m/z的二級(jí)質(zhì)譜見(jiàn)圖4。圖4中條帶b的一級(jí)質(zhì)譜圖及代表母離子1 868 m/z的二級(jí)質(zhì)譜見(jiàn)圖5。通過(guò)MASCOT數(shù)據(jù)庫(kù)搜索比對(duì)質(zhì)譜鑒定的多肽序列，結(jié)果見(jiàn)表1。條帶a被鑒定為N-乙?；邗?L-丙氨酸酰胺酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase)，理論相對(duì)分子量為83.5 kDa。條帶b被鑒定為含有LysM肽聚糖結(jié)合蛋白(LysM peptidoglycan-binding domain-containing protein)，理論相對(duì)分子量為51.1 kDa。

M：標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker；1：戊糖片球菌表層提取物。圖3 P. pentosaceus F28-8 LiCl提取物的 SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of LiCl extract of P. pentosaceus F28-8

圖4 P. pentosaceus F28-8表面蛋白中條帶a的質(zhì)譜分析Fig.4 Mass spectrometric analysis of band a in surface protein of P. pentosaceus F28-8

2.3 表面蛋白對(duì)戊糖片球菌表面性質(zhì)的影響

表面蛋白對(duì)戊糖片球菌表面性質(zhì)的影響見(jiàn)圖6。

圖5 P. pentosaceus F28-8表面蛋白中條帶b的質(zhì)譜分析Fig.5 Mass spectrometric analysis of band b in surface protein of P. pentosaceus F28-8

條帶NCBI檢索號(hào)理論相對(duì)分子量/kDa分值蛋白名稱(chēng)agi|ASCO889083466497N-acetylmuramoyl-L-alanine amidasebgi|WP_023440519 51087239LysM peptidoglycan-binding domain-containing protein

經(jīng)LiCl處理失去表面蛋白后，戊糖片球菌的表面疏水性、自動(dòng)聚集能力、表面電荷(三氯甲烷處理)和表面電荷(乙酸乙酯處理)均顯著性降低，降幅分別達(dá)到34.4%、19.4%、56.1%、19.0%。由此推斷，表面蛋白結(jié)構(gòu)對(duì)戊糖片球菌維持表面疏水性、自動(dòng)聚集能力和表面電荷起重要作用，進(jìn)而可能對(duì)菌株的非特異性黏附能力產(chǎn)生影響。

2.4 戊糖片球菌表層提取物對(duì)黏附性的影響

鑒于2.3結(jié)果，對(duì)去除表面蛋白的戊糖片球菌與未去除表面蛋白的戊糖片球菌的黏附能力進(jìn)行了研究，結(jié)果見(jiàn)圖7。圖7(a)中，相比正常戊糖片球菌，去除表面蛋白導(dǎo)致戊糖片球菌的黏附力顯著降低，對(duì)膠原蛋白的黏附率降低了48.2%，說(shuō)明表面蛋白對(duì)戊糖片球菌的黏附能力至關(guān)重要。

進(jìn)一步研究了戊糖片球菌表面蛋白對(duì)S.entericasubsp. CICC 21513和S.aureusCICC 21600與膠原蛋白黏附作用的影響。圖7(b)和圖7(c)中，添加戊糖片球菌表面蛋白導(dǎo)致S.entericasubsp. CICC 21513和S.aureusCICC 21600黏附膠原蛋白的能力顯著下降，黏附菌落數(shù)均有顯著減少。S.entericasubsp. CICC 21513和S.aureusCICC 21600黏附菌落數(shù)分別降低了74.59%和81.16%。由此可見(jiàn)，戊糖片球菌的表面蛋白參與了不同菌株黏附膠原蛋白的過(guò)程，降低了致病菌的黏附性。

2.5 戊糖片球菌表面蛋白的抑菌性分析

鑒于戊糖片球菌F28-8表面蛋白具有N-乙?；邗?L-丙氨酸酰胺酶活性，以及對(duì)致病菌黏附能力的負(fù)作用，進(jìn)一步研究了戊糖片球菌表面蛋白對(duì)S.entericasubsp. CICC 21513和S.aureusCICC 21600的抑菌活性，結(jié)果見(jiàn)圖8。圖8顯示，在培養(yǎng)10 h時(shí)，相比對(duì)照組，添加表面蛋白的處理組對(duì)S.entericasubsp. CICC 21513和S.aureusCICC 21600的抑菌率分別為31.5%和15.6%。結(jié)果表明，戊糖片球菌表面蛋白對(duì)S.entericasubsp. CICC 21513的抑菌效果稍強(qiáng)于S.aureusCICC 21600，原因可能是LiCl提取物中除了能有效抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌因子外，還存在能抑制革蘭氏陰性菌的其他抑菌因子。有關(guān)抑菌因子的分離、鑒定及其抑菌譜，有待進(jìn)一步研究。

表面疏水性：菌體與二甲苯混合后對(duì)其的吸附率；自動(dòng)聚集性：菌體渦旋并靜置4 h后的自動(dòng)聚集能力；表面電荷：菌體與三氯甲烷(乙酸乙酯)混合后對(duì)其的吸附率；SLP+：未去除表面蛋白菌株，SLP-：去除表面蛋白菌株；“*”表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異顯著(P<0.05)。圖6 P. pentosaceus F28-8失去表面蛋白前后的表面性質(zhì)Fig.6 Surface properties of P. pentosaceus F28-8 before and after loss of surface protein

3 結(jié) 論

通過(guò)透射掃描電鏡、SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS等手段證實(shí)P.pentosaceusF28-8存在表面結(jié)構(gòu)及表面蛋白，經(jīng)鑒定表面蛋白中含有主要成分N-乙?；邗?L-丙氨酸酰胺酶和LysM肽聚糖結(jié)合域蛋白。進(jìn)一步研究表明，戊糖片球菌表面蛋白對(duì)菌株的表面性質(zhì)具有極顯著影響(P<0.01)，該表面蛋白可競(jìng)爭(zhēng)性抑制致病菌的黏附作用，并具備一定的抑菌作用。

SLP+：未去除表面蛋白菌株；SLP-：去除表面蛋白菌株；CK：未添加表面蛋白組；+SLP：添加表面蛋白組；“*”表示實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)。圖7 P. pentosaceus F28-8表面蛋白對(duì)菌株黏附的影響Fig.7 Effect of P. pentosaceus F28-8 surface protein on adhesion of strains

圖8 P. pentosaceus F28-8表面蛋白對(duì)沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effect of P. pentosaceus F28-8 surface protein on growth of Salmonella and Staphylococcus aureus