羅瑞漣

(佛山市質量計量監(jiān)督檢測中心， 廣東 佛山 528225)

四環(huán)素類抗生素在畜牧業(yè)中廣泛應用[1]，但該類抗生素在動物源性食品中的過量殘留會危害人類的健康，如損害肝臟，引起牙黃和腸胃功能紊亂，產(chǎn)生過敏和抗藥性等[2]。為此，歐盟及我國均制定了四環(huán)素類抗生素單個或復合物在動物源性食品中的最大殘留限量，為100 μg/kg[3-4]。

奶粉作為嬰幼兒攝取營養(yǎng)的重要食品，全世界都十分關注其安全性。然而，嬰兒配方奶粉中四環(huán)素類抗生素的殘留限量還沒有出臺相關的規(guī)定。為此，有必要開發(fā)靈敏度高、檢出限盡可能低的測定嬰兒配方奶粉中四環(huán)素類抗生素的方法。目前，奶粉中四環(huán)素類抗生素的檢測方法主要有液相色譜-紫外檢測法[5]、高效液相色譜- 串聯(lián)質譜法[6]和超高效液相色譜- 串聯(lián)質譜法[7]。樣品中四環(huán)素類抗生素的提取凈化方法主要有固相萃取法和液液萃取法。近年來，又衍生出了鹽析液液萃取法。這種方法是向樣品溶液和強極性有機溶劑組成的混合物中加入適當?shù)柠}類化合物，促使有機溶劑更好地從混合物中分離出來[8]。該方法簡單、快速，在大大減少有機溶劑使用量的同時，能夠提高四環(huán)素類抗生素這類極性化合物的萃取效率。國內(nèi)外的研究均已將鹽析液液萃取法應用在食品檢測上[8-12]，實驗結果均表明該方法對目標化合物的萃取凈化效果較好，操作快速可靠、靈敏度高，有較高的回收率和較低的檢出限，經(jīng)濟適用性較好。鑒于鹽析輔助液液萃取法的優(yōu)越性，文章率先采用該法來提取嬰兒配方奶粉中的四環(huán)素類抗生素，并結合超高效液相色譜- 串聯(lián)質譜法檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽酸四環(huán)素(97.7%)、鹽酸土霉素(97.5%)、鹽酸金霉素(93.0%)、鹽酸強力霉素(98.0%)，購于Sigma公司。甲酸、甲醇、乙腈，均為色譜純，購于德國安譜公司。乙酸乙酯、乙腈、十二水合磷酸氫二鈉(磷酸氫二鈉)、一水合檸檬酸(檸檬酸)、乙二胺四乙酸二鈉、硫酸銨、草酸銨，均為分析純，購于廣州化學試劑廠?；菔蠣I養(yǎng)品(中國)有限公司嬰兒配方奶粉，購于某大型超市。

1.2 儀器與設備

Quattro Premier XE型超高效液相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜儀(UPLC-MS/MS)，美國Waters公司；OA-SYS型水浴氮吹儀，美國Organomation公司；T-214型電子天平，德國Sartorius公司；XW-80A型旋渦混合器，上海馳唐電子有限公司；KQ-500VDE型超聲清洗儀，昆山儀器有限公司；SHY-2型振蕩器，常州萬合儀器有限公司；TGL-16M型離心機，上海盧湘儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1溶液配制

Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖液：分別稱取2.10 g檸檬酸和2.84 g磷酸氫二鈉，分別用水溶解并定容至100 mL，配制成0.1 mol/L的檸檬酸溶液和0.2 mol/L的磷酸氫二鈉溶液；取100 mL檸檬酸溶液與62.5 mL磷酸氫二鈉溶液混合，并加入6.05 g乙二胺四乙酸二鈉，使其溶解，搖勻，必要時用氫氧化鈉或鹽酸調pH值至4.00±0.05，即得0.1 mol/L的Na2EDTA-Mcllvaine緩沖液。

標準溶液配制：分別精確稱取4種四環(huán)素類抗生素標準品2.5 mg，用甲醇溶解并定容至25 mL，配制成質量濃度為100 μg/mL的標準儲備液，于-18 ℃下避光保存。根據(jù)需要用體積分數(shù)50%乙腈水溶液逐級稀釋，配制成合適濃度的混合標準工作液。

1.3.2樣品溶液的制備

稱取1 g樣品置于50 mL離心管中，添加1.5 mL Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液，于旋渦混合器上充分混勻后，置于超聲清洗儀中超聲20 min。然后加入3.5 mL乙腈，置于振蕩器上振蕩混勻15 min。隨后加入1.32 g(NH4)2SO4，渦旋混勻后，4 500 r/min離心5 min，上清液N2吹干，溫度低于40 ℃。將殘渣溶于1 mL 50%乙腈水溶液中，過0.22 μm PTFE濾膜，濾液待上機測定。

1.3.3基質標準溶液的制備

不含待測物的樣品按1.3.2節(jié)的方法提取，得到空白基質溶液。以空白基質溶液作為溶劑配制系列混合基質標準溶液，使基質標準溶液中四環(huán)素類抗生素的質量濃度分別為1、5、20、50、100 ng/mL。

1.3.4UPLC-MS/MS檢測條件

1) UPLC條件。色譜柱：Acquity UPLC BEH C18，1.7 μm，100 mm×2.1 mm；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 μL；流動相：A為甲酸水溶液(體積分數(shù)0.1%)，B為乙腈(色譜純)；流速：0.2 mL/min；梯度洗脫程序列于表1。

表1 UPLC梯度洗脫程序

2) 質譜參數(shù)。電離方式：電噴霧正離子(ESI+)模式；毛細管電壓：2.5 kV；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑溫度：300 ℃；脫溶劑氣流：N2，流速500 L/h；錐孔氣流：N2，流速50 L/h；碰撞氣：氬氣，流速0.12 mL/min；掃描模式：多反應監(jiān)測(MRM)。

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

在調諧條件下通過注射器直接進樣，分別對1 μg/mL的各個標準溶液進行母離子和子離子掃描，確定定量和定性離子對，對毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞能和駐留時間等參數(shù)進行了優(yōu)化，主要的優(yōu)化參數(shù)見表2。4種四環(huán)素類抗生素的總離子色譜圖如圖1。從圖1中可以看出，4種藥物可以在4.5 min內(nèi)實現(xiàn)快速分離檢測。

2.2 提取和凈化條件的優(yōu)化

2.2.1萃取溶劑對萃取效果的影響

液液萃取方法中，有機萃取溶劑的選擇至關重要。在日常的食品安全檢測中，常用的有機溶劑有甲醇、乙腈、乙酸乙酯、丙酮等。實驗選取了乙腈和乙酸乙酯作為研究對象，按照1.3.2節(jié)的方法處理樣品，通過目標化合物的平均回收率來評價兩者的萃取效果，結果見圖2。從圖2中數(shù)據(jù)可見，采用乙腈作為萃取溶劑時，4種四環(huán)素類抗生素的平均回收率較高，說明相比于極性較弱的乙酸乙酯，具有強極性的乙腈萃取含有極性基團的四環(huán)素類抗生素的效果更好。而且，乙腈還具有沉淀蛋白質的能力，能降低基質效應的影響，提高凈化效果。此外，為了考察萃取溶劑的體積對樣品溶液中目標化合物的萃取效率，在5 μg/kg的加標水平下使用不同體積的乙腈作為萃取溶劑進行萃取實驗，體積變化范圍為2.0～4.0 mL。結果顯示，隨著乙腈體積的增加，4種四環(huán)素類抗生素的平均回收率呈上升趨勢；當乙腈體積大于3.5 mL時，4種四環(huán)素類抗生素的平均回收率增加不明顯。綜合考慮，以3.5 mL的乙腈作為萃取溶劑。

表2 保留時間及串聯(lián)質譜參數(shù)

*代表定量離子。

圖1 4種四環(huán)素類抗生素混合標準品總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of 4 tetracyclines mixed standard solution

圖2 不同有機溶劑的萃取效果Fig.2 Extraction effects of different organic solvents

2.2.2銨鹽對萃取效果的影響

不同類型的銨鹽對液液萃取過程中相分離的程度存在一定的影響。銨鹽相比于其他鹽類，在電離室能夠輕易揮發(fā)或分解，從而避免對質譜造成損害，是一類質譜友好的鹽類化合物[13]。文章研究了硫酸銨和草酸銨在液液萃取方法中對相分離程度的影響。從目標化合物的回收率實驗結果(圖3)可見，硫酸銨在液液萃取過程中，能更好地促進乙腈和水相的分離，從而提高目標化合物的萃取效率，而且回收率的重現(xiàn)性也比草酸銨更好。對于硫酸銨的用量，本文也做了相關的研究。實驗時逐步添加鹽的用量至其不能溶解。研究表明，當硫酸銨用量小于1.32 g時，4種四環(huán)素類抗生素均獲得了不錯的回收率；繼續(xù)增加硫酸銨的用量，目標化合物的平均回收率幾乎不再增加，且還有下降的趨勢；而且觀察加鹽后混合液的分層情況，發(fā)現(xiàn)加鹽量大于1.32 g時，有部分硫酸銨不能完全溶解，可能此時硫酸銨在樣品混合液中已經(jīng)達到飽和。綜上所述，選擇硫酸銨的用量為1.32 g。

圖3 不同類型銨鹽對相分離程度的影響Fig.3 Phase separation effects of different ammonium salts

2.2.3萃取方法對萃取效果的影響

文章對比了固相萃取法和鹽析輔助液液萃取法對目標化合物的提取效果。固相萃取法參照GB/T 21317—2007的方法對樣品進行前處理[14]。采用HLB固相萃取柱凈化，4種四環(huán)素類抗生素殘留的回收率明顯偏低，而且相對標準偏差也偏大(見圖4)。從4種化合物的總離子流圖可以看出，鹽析輔助液液萃取法的凈化效果較好，色譜圖中雜峰較少(見圖5)。原因可能是嬰兒配方奶粉中蛋白質含量較高，容易造成固相萃取柱的堵塞，使得目標化合物不能完全洗脫，洗脫液中也含有較多雜質。也可能是因為不同批次的HLB固相萃取柱里面的填料質量參差不齊，難以保證目標化合物獲得穩(wěn)定的回收率。

圖4 不同凈化方法的提取效果Fig.4 Extraction effects of different purification methods

圖5 不同凈化方法的總離子流圖Fig.5 Total ion chromatogram of different purification methods

2.3 基質效應、線性范圍、檢出限和加標回收率分析

研究基質效應最常用的方法是相對響應值法，即基質效應=空白基質標準響應值/純?nèi)軇藴薯憫怠．敾|效應大于1時，表明存在基質增強效應；反之，則存在基質抑制效應[15]。分別用奶粉空白提取液和純?nèi)軇┡渲? ng/mL和50 ng/mL 2個混合標準溶液，比較其測得的響應值(峰面積)，從而考察基質效應，結果見表3。結果顯示，樣品基質對4種四環(huán)素類抗生素均有增強效應，因此基質效應不可忽略，應采用基質匹配標準曲線進行定量，以提高結果的準確性。

實驗中，測定1.3.3節(jié)中的混合基質標準溶液，繪制標準曲線，其中縱坐標Y是每種抗生素定量離子的色譜峰面積，橫坐標X是對應的質量濃度(ng/mL)，結果見表3。結果表明，在1～100 ng/mL的濃度范圍內(nèi)，4種四環(huán)素類抗生素的含量與其峰面積均呈現(xiàn)出良好的線性關系。

表3 4種四環(huán)素類抗生素的線性方程和相關系數(shù)

根據(jù)國際純粹與應用化學聯(lián)合會(IUPAC)對檢出限的定義，實驗將低濃度的混合標準溶液添加到陰性嬰兒配方奶粉中，使樣品中標準品的質量比分別為0.5 μg/kg和1 μg/kg，處理方法同1.3.2節(jié)，每個水平平行測定6次，計算各目標化合物峰面積的標準偏差，以3倍標準偏差計算各個化合物的檢出限(置信水平P=95%)，最終選取檢出限最低的化合物所對應的結果作為本方法的檢出限[16]。結果顯示，這2個水平的檢出限分別為0.36 μg/kg和0.67 μg/kg。然后，按照1.3.2節(jié)中的方法驗證，發(fā)現(xiàn)4種四環(huán)素類抗生素與空白奶粉樣品的質量比均為0.36 μg/kg時，在超高效液相色譜-質譜聯(lián)用儀上仍然有響應，并且信噪比S/N>3，因此，確定0.36 μg/kg為該方法的檢出限。

以不含目標化合物的嬰兒配方奶粉為基質，加入一定量的混合標準溶液，使目標化合物在樣品中的質量比分別為1、5、50 μg/kg，每個加標水平平行測定4次，結果見表4。實驗平均回收率在71.88%～107.13%，方法的相對標準偏差小于8%，可以滿足日常檢測工作的需要。

表4 4種四環(huán)素類抗生素加標回收率測定結果

3 結 論

研究了鹽析液液微萃取-超高效液相色譜- 串聯(lián)質譜法檢測嬰兒配方奶粉中四環(huán)素、土霉素、金霉素和強力霉素這4種四環(huán)素類抗生素的方法。該方法下4種四環(huán)素類抗生素在4.5 min內(nèi)即可實現(xiàn)快速分離檢測；最低檢出限為0.36 μg/kg，遠遠低于國標中固相萃取法的50 μg/kg；質量濃度為1～100 ng/mL時，4種化合物線性相關，相關系數(shù)均在0.999 0以上；加標濃度為1、5、50 μg/kg時的平均回收率為71.88%～107.13%，相對標準偏差均小于8%，滿足四環(huán)素類抗生素常規(guī)檢測的需要。本方法大大減少了有機溶劑的用量，簡單快速、經(jīng)濟可靠、靈敏度高、環(huán)境友好，適用于嬰兒配方奶粉中四環(huán)素類抗生素的定性定量分析。