阮俊勇，雷濤，董旭，翟明明，羅二平

1. 空軍軍醫(yī)大學(xué) 軍事生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系 軍隊(duì)衛(wèi)生裝備教研室，陜西 西安 710032

2. 海軍青島第一療養(yǎng)院 器材科，山東 青島 266071

引言

醫(yī)學(xué)上的高原是指能引起明顯生物學(xué)效應(yīng)的海拔3000 m以上的廣泛地區(qū)，是高原病的多發(fā)地區(qū)[1]。根據(jù)波義耳定律可知，氣體體積與壓強(qiáng)成反比，隨著海拔高度的增加，壓強(qiáng)會降低，空氣體積會變大，而空氣中氧氣濃度始終保持不變 [20.9% (V/V)]，所以隨著海拔高度的增加，單位體積空氣中氧的含量會逐漸減少，從而引發(fā)高原缺氧問題。正常成年人腦重占體重2%左右，但其耗氧量卻達(dá)到了全身耗氧量的20%，而且腦組織的代謝主要以高耗氧的有氧代謝為主，對缺氧十分敏感[2-3]，因此，在高原低氧環(huán)境下，高級神經(jīng)活動的改變往往出現(xiàn)的較早且較為明顯。作為大腦邊緣系統(tǒng)的組成部分，海馬區(qū)主要負(fù)責(zé)記憶的存儲轉(zhuǎn)換、信息鞏固和空間定向等功能，在認(rèn)知功能中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[4]，而海馬區(qū)對低氧有選擇性易感性[5]。因此研究低氧環(huán)境下富氧干預(yù)對海馬結(jié)構(gòu)以及認(rèn)知功能的影響很有必要。同時，大量文獻(xiàn)表明[6-9]，睡眠有助于長時程增強(qiáng)的形成，進(jìn)而促進(jìn)記憶（尤其是空間記憶）的鞏固，因此我們主要對低氧大鼠在睡眠期間進(jìn)行富氧干預(yù)。本研究采用小型動物實(shí)驗(yàn)用環(huán)境模擬艙模擬高原環(huán)境，使用膜法氧氣機(jī)結(jié)合獨(dú)立通氣籠盒（Individual Ventilated Cages，IVC）提供富氧干預(yù)，針對急性低壓低氧環(huán)境和富氧干預(yù)對SD大鼠認(rèn)知功能及海馬體的影響進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

本實(shí)驗(yàn)采用健康SPF級雄性SD（Sprague-Dawley）大鼠30只，7周齡左右，體重（211.40±18.58）g，均由空軍軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供。領(lǐng)取大鼠后在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)3 d適應(yīng)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)室明暗交替為12 h:12 h，采用空調(diào)24 h通風(fēng)，溫度控制在20℃左右，相對濕度控制在40%～70%，保證飲水充足，在保證不斷食的情況下每次給食之間不出現(xiàn)剩余。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)所用小型動物實(shí)驗(yàn)用環(huán)境模擬艙由空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系與蘇州市利安特醫(yī)療設(shè)備有限公司聯(lián)合研制，該設(shè)備艙體為鋼化玻璃，便于觀察記錄艙內(nèi)實(shí)驗(yàn)過程，通過交替繼電器控制兩個真空泵以1 h為周期輪換工作對艙體進(jìn)行抽氣，設(shè)置粗調(diào)、微調(diào)兩個氣源調(diào)節(jié)閥調(diào)整艙體進(jìn)出氣比例以達(dá)到模擬高原低壓低氧環(huán)境，裝配有指針式壓力表和控制顯示面板雙重監(jiān)測艙體內(nèi)壓力[10]，內(nèi)置溫濕度監(jiān)測顯示儀。

實(shí)驗(yàn)所用便攜式膜法氧氣機(jī)是由空軍軍醫(yī)大學(xué)軍事生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)系軍隊(duì)衛(wèi)生裝備教研室自主研制，主要由風(fēng)機(jī)、過濾網(wǎng)、真空泵、富氧膜組件和氣體緩沖室組成，根據(jù)膜法富氧技術(shù)，以空氣為原料，真空泵產(chǎn)生負(fù)壓使空氣通過富氧膜組件后得到富氧空氣[11]，富氧濃度為（30%±3% V/V），流量為（6±1）L/min。課題組通過大量模擬高原環(huán)境與高原地區(qū)實(shí)地測試發(fā)現(xiàn)，該氧氣機(jī)能顯著改善急進(jìn)高原人群心率、血氧飽和度、PWC170、抗氧化應(yīng)激能力等一系列生理指標(biāo)，能夠有效提高急進(jìn)高原人群的抗缺氧能力，極大減少高原反應(yīng)的發(fā)生[12-15]。

實(shí)驗(yàn)所用上海移數(shù)信息科技有限公司生產(chǎn)的Morris水迷宮系統(tǒng)可以自動監(jiān)測、記錄、分析動物行為實(shí)驗(yàn)過程，水池直徑為2 m，水深0.5 m，分為四個象限，平臺設(shè)置在水下2 cm，并用食物色素染黑水池便于記錄白色大鼠行為軌跡及掩蓋平臺。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

對30只SD大鼠編號后采用隨機(jī)數(shù)字表法完全隨機(jī)分為三組：平原對照組（NC組）、低壓低氧組（LO組）、低壓富氧組（HO組），每組10只。

1.3.2 定位航行訓(xùn)練

正式開始實(shí)驗(yàn)前一天，讓大鼠適應(yīng)性游泳2 min（取下平臺），以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，然后對三組大鼠同時進(jìn)行為期5天的獲得性定位航行訓(xùn)練，每只大鼠每天訓(xùn)練4次，每次訓(xùn)練最長時間為1 min，記錄大鼠找到并爬上平臺的潛伏期（逃避潛伏期），如果1 min后仍未找到平臺，則引導(dǎo)其到達(dá)平臺并站立10 s，每天訓(xùn)練結(jié)束后擦拭烘干大鼠身上水分后放歸實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)飼養(yǎng)。第6天將大鼠按分組進(jìn)行不同條件干預(yù)。

1.3.3 模擬高原環(huán)境及富氧干預(yù)環(huán)境的建立

利用小型動物實(shí)驗(yàn)用環(huán)境模擬艙模擬海拔6000 m建立缺氧環(huán)境，利用便攜式膜法氧氣機(jī)結(jié)合IVC籠盒建立富氧環(huán)境，在海拔6000 m時籠盒內(nèi)氧氣濃度為28.4%（上下浮動不超過0.5%），同時在富氧籠盒內(nèi)放置CO2吸附劑，控制CO2濃度在5%以下。定位航行訓(xùn)練結(jié)束后將LO組置于低壓艙內(nèi)、將HO組置于低壓艙內(nèi)的富氧籠盒內(nèi)、將NC組置于低壓艙外進(jìn)行飼養(yǎng)。其中富氧組每天富氧時間為12 h，其余時間飼養(yǎng)于低壓艙內(nèi)，考慮到大鼠晝伏夜出，富氧干預(yù)設(shè)置在白天，主要模擬高原人群睡眠時間進(jìn)行富氧干預(yù)。保證三組大鼠食水充足，定時更換墊料。

1.3.4 空間探索能力測試

分組干預(yù)3 天以后分別測試三組大鼠空間探索能力，將Morris水迷宮內(nèi)水下平臺撤去，選擇目標(biāo)平臺兩側(cè)象限將大鼠分兩次放入水池，記錄2 min內(nèi)大鼠穿越平臺次數(shù)，計兩次穿越平臺次數(shù)平均值作為空間記憶能力指標(biāo)，實(shí)驗(yàn)過程如圖1a所示。

1.3.5 大鼠海馬CA1區(qū)病理觀察

空間探索測試結(jié)束之后立即對大鼠進(jìn)行10%水合氯醛麻醉，冰上取海馬組織，浸泡于4%甲醛溶液內(nèi)，待完全固定后，使用不同濃度乙醇進(jìn)行梯度脫水后用石蠟包埋，采用蘇木精—伊紅染色（HE染色）后，在光鏡下觀察其病理改變。每組選取5個400倍CA1視野進(jìn)行拍照并記錄變性錐體細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 空間探索能力

空間探索實(shí)驗(yàn)（圖1a）結(jié)果顯示，LO組大鼠穿越平臺次數(shù)（2.55±0.64）顯著低于 NC 組（6.75±0.95）（P＜0.05）和HO組（6.20±0.79）（P＜0.05），HO組和NC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1b。

圖1 Morris水迷宮和穿越平臺次數(shù)統(tǒng)計

2.2 腦組織病理形態(tài)學(xué)改變

大鼠海馬CA1區(qū)HE染色結(jié)果，見圖2a，可以看出NC組海馬錐體細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊密集，胞核大而圓，染色呈均勻淡藍(lán)色或藍(lán)色，核仁清楚，細(xì)胞質(zhì)豐富，層次及細(xì)胞線清晰。LO組海馬錐體細(xì)胞排列散亂，胞核體積縮小，染色加深，與胞質(zhì)界線不清，出現(xiàn)大量空泡樣變。HO組海馬錐體細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷顯著減輕，排列方式相對整齊，與NC組對照無顯著差異。每組選取5個400倍CA1視野進(jìn)行拍照并記錄變性錐體細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果顯示，模擬6000 m海拔高原環(huán)境LO組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞變性數(shù)（73.60±19.79）明顯多于 NC 組（3.80±2.39）（P＜0.05）和HO組（3.40±3.21）（P＜0.05），HO組和NC組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖2b。

圖2 海馬CA1區(qū)HE染色典型性光鏡照片和椎體細(xì)胞變異數(shù)統(tǒng)計

3 討論

高原地區(qū)自然環(huán)境特殊，晝夜溫差大、紫外線輻射強(qiáng)、干燥等氣候特征都會對急進(jìn)高原人群造成一定的影響，但屬低氧帶來的各種急慢性高原反應(yīng)對人體健康威脅最大。加上隨著交通的日益便利，人們進(jìn)入高原的節(jié)奏大大加快，因此研究急性低壓低氧環(huán)境對人體腦—體功效方面的影響以及尋找可靠有效的應(yīng)對措施就顯得尤為重要。大量研究表明，急性低壓低氧環(huán)境會對動物海馬組織造成一定的病理改變，并引起其空間學(xué)習(xí)和記憶等認(rèn)知功能損傷，嚴(yán)重時可導(dǎo)致腦死亡[16-18]。付中偉等[19]將20只SD大鼠隨機(jī)分為平原對照組和模擬6000 m海拔低氧暴露7 d、每天暴露12 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)低氧組大鼠穿越平臺次數(shù)明顯小于對照組（P＜0.05）。史清海等[20]將56只SD大鼠隨機(jī)分為平原對照組和模擬6000 m海拔低氧暴露2、4、6、8、10、12 d組，之后對各組進(jìn)行Morris水迷宮定位航行訓(xùn)練和空間探索測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各低氧組大鼠穿越平臺次數(shù)均顯著少于對照組（P＜0.05），且低氧暴露2 d組穿越平臺次數(shù)最少。是文輝等[21]將50只SD大鼠隨機(jī)分為常壓對照組和模擬5000 m海拔急性低壓低氧暴露1、2、3、7 d組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)暴露3 d組大鼠腦組織病理學(xué)改變最為顯著，但隨著暴露時間的延長，這種損傷程度會有所降低，這可能和低氧習(xí)服機(jī)制有關(guān)。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在低氧組的趨勢與上述研究具有一致性。更重要的是我們發(fā)現(xiàn)Morris水迷宮空間探索測試結(jié)果表明，模擬6000 m海拔高度急性低壓低氧暴露會導(dǎo)致大鼠空間記憶功能障礙，而采用膜法氧氣機(jī)在睡眠期間進(jìn)行富氧干預(yù)能顯著減輕低氧帶來的認(rèn)知功能損傷。進(jìn)一步分析海馬形態(tài)結(jié)構(gòu)可知，低氧組大鼠海馬CA1區(qū)椎體細(xì)胞變性數(shù)量顯著增加，而富氧組與平原對照組無顯著差異。這說明在急性低壓低氧環(huán)境下采用膜法氧氣機(jī)進(jìn)行富氧干預(yù)能有效減輕低氧對神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)損傷，從而在一定程度上保證了其能完成正常的學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能。當(dāng)然，低氧導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的原因錯綜復(fù)雜，而富氧干預(yù)帶來的改善也不止于此，本實(shí)驗(yàn)僅探索到其中的一小部分，還需要進(jìn)行更加深入地研究。

4 結(jié)論

以往解決高原缺氧問題的相關(guān)研究大多集中在藥物治療方面，而隨著便攜式膜法氧氣機(jī)的成熟和普及，很快就以其使用便捷、見效快、無副作用、人群普遍耐受等優(yōu)勢備受歡迎，對膜法氧氣機(jī)的應(yīng)用研究也越來越多。本文通過研究模擬急性低壓低氧環(huán)境對大鼠認(rèn)知功能的弱化以及海馬CA1區(qū)病理改變，確定采用膜法氧氣機(jī)進(jìn)行富氧干預(yù)能有效保護(hù)其海馬神經(jīng)元細(xì)胞，并使其認(rèn)知功能顯著提高甚至達(dá)到平原水平，為膜法氧氣機(jī)的應(yīng)用效果提供了有效實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為下一步進(jìn)行人體實(shí)驗(yàn)奠定理論基礎(chǔ)。