羅 剛，王 杰，賴添賦，甘明川，賴松家

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物遺傳育種研究所，四川成都 611130）

抗寒性是動物適應(yīng)環(huán)境的一種能力，動物的抗寒性對動物的生長速度、初生牛成活率和牛產(chǎn)品生產(chǎn)量有很大的影響。在一些高海拔地區(qū)，因其氣溫低，環(huán)境差，只能生存生長速度很慢的本地牦牛，且初生牛死亡率非常高，大大影響了牛肉產(chǎn)品的多樣性和牛肉產(chǎn)量。因此，培育出抗寒性強(qiáng)的黃牛和初生牛死亡率低的新品種將成為當(dāng)代畜牧業(yè)發(fā)展，尤其是高海拔地區(qū)牛業(yè)發(fā)展的緊迫任務(wù)。

動物的抗寒性一般從體內(nèi)的反應(yīng)供熱和體外的毛皮保溫兩方面來體現(xiàn)。體內(nèi)產(chǎn)熱御寒途徑之一是脂肪代謝通過leptin減少外周組織脂肪堆積、增加棕色脂肪中線粒體的活性和解偶聯(lián)蛋白質(zhì)1（uncoupling protein-1，UCP-1）含量，提高非震顫性產(chǎn)熱（nonshivering thermogenesis，NST）來抵抗高原寒冷環(huán)境[1]。解偶聯(lián)蛋白（uncoupling protein，UCPs）是褐色脂肪細(xì)胞線粒體內(nèi)膜上存在的一種質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它存在于動物的各組織中，在能量平衡、維持體溫、機(jī)體產(chǎn)熱和代謝等方面都起著巨大的作用[2-7]。BAT細(xì)胞中游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FA）氧化和產(chǎn)熱主要與BAT細(xì)胞具有大量的線粒體有關(guān)，因此代謝活性強(qiáng)；BAT線粒體含有特殊的UCP1蛋白[8]。BAT細(xì)胞中UCP1介導(dǎo)的質(zhì)子漏而產(chǎn)生的NST可以在冷暴露下動物維持正常體溫[9]，BAT的產(chǎn)熱能力主要依賴于其線粒體內(nèi)膜上的UCP1，UCP1基因表達(dá)增加是BAT產(chǎn)熱能力增強(qiáng)的主要分子機(jī)制[10-11]。UCP1基因水平的調(diào)節(jié)在UCP1含量和BAT產(chǎn)熱調(diào)節(jié)中起著決定作用，是BAT產(chǎn)熱生理調(diào)節(jié)的中心[12]。UCP1基因敲擊小鼠在冷暴露條件下表現(xiàn)出致命的低體溫現(xiàn)象（Life-threatening hypothermia）[13]。

鑒于UCP1基因在能量代謝和產(chǎn)熱過程中的重要作用，我們推測其在?？购矫婵赡馨l(fā)揮直接或間接的作用，但是目前尚未見到相關(guān)報道。因此，本研究擬以UCP1目標(biāo)基因，選取生活在平均海拔5 000 m、年平均溫度-13℃的西藏牦牛、生活在平均海拔2 700 m、年平均溫度-8.7℃的西藏黃牛和平均海拔600 m、年平均溫度16.7℃的通江黃牛為試驗動物，采用PCR擴(kuò)增和直接測序的方法，利用分子生物學(xué)軟件從遺傳的角度分析了不同基因型及基因型組合對不同牛種抗寒的影響，以期為高原?？购苑肿佑N提供新的理論方法和新思路。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

西藏牦牛來自西藏最高海拔的雙湖縣，西藏黃牛來自西藏海拔較低的波密縣牧場，通江黃牛來自通江縣通江黃牛的組織樣，實驗均采集了耳組織，置于在75%乙醇、容積為1.5 mL的小試管、保存于-20℃冰箱備用。

1.2 基因組DNA的提取及檢測

采用中國北京天根生物技術(shù)公司的DNA提取試劑盒提取DNA，方法參照試劑盒說明書。并用0.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量,紫外分光光度計測定DNA濃度,然后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3UCP1基因PCR擴(kuò)增、測序

根據(jù)牛的基因序列（GeneBank編號AC_000174）設(shè)計UCP1基因5對引物，并由上海生工生物有限公司合成，引物詳情見表1。PCR采用25μL反應(yīng)體系：PCR Master Mix：12.5 μL、上游引物：1 μL、下游引物：1 μL、模板：2.5 μL 和 ddH2O：8 μL 的反應(yīng)體系。PCR擴(kuò)增程序為：94 ℃：5 min；94 ℃：30 s；56.8 ℃、54.6 ℃或者 59.2 ℃：30 s；72 ℃：30 s；72 ℃：10 min 條件，擴(kuò)增38個循環(huán)。

1.4 PCR產(chǎn)物回收、測序

擴(kuò)增之后把用瓊脂糖凝膠電泳檢測效果，經(jīng)檢測合格的擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后，送到上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測序。公司將提供的需要分析的核苷酸樣本與測序酶同時放置在0.2PCR薄壁管中，向其中加入primer（DNA引物）、測序反應(yīng)試劑盒（內(nèi)含 dNTP、緩沖液、測序酶）、超純水、Mg2+等擴(kuò)增所需原料，混合振蕩均勻；再將薄壁管放置在PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）儀中，在PCR儀中擴(kuò)增反應(yīng)約1.5 h后取出，添加醋酸鈉、乙醇等，將擴(kuò)增樣品中DNA進(jìn)行沉淀，離心分離、烘干；再使用緩沖液將其DNA溶解，即可上測序儀進(jìn)行分析測試。測序儀配套計算機(jī)顯示測試結(jié)果。

表1 牛UCP1基因引物信息Table 1 Primer information of bovine UCP1 gene

1.5 UCP1基因遺傳多態(tài)性分析

將所得測序結(jié)果與NCBI上（GenBank登錄編號AC_000174）下載的牛的相應(yīng)序列用Seqman 5.01軟件查看峰圖，并找出變異位點的基因型和等位基因，用MEGA 5.5軟件計算出在3個牛品種在UCP1基因個外顯子上的堿基含量，使用excel軟件計算程序計算變異位點的基因型頻率和等位基因頻率。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用R 3.4統(tǒng)計軟件的χ獨(dú)立性檢驗程序進(jìn)行SNPs位點基因型與抗寒性關(guān)聯(lián)分析（P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著）。

2 結(jié)果

2.1 牛UCP1基因遺傳多態(tài)性的分析結(jié)果

牛UCP1基因的擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示?？梢钥闯?，PCR 條帶分別接近于 661、750、752、800、700 bp，且條帶單一整齊、清晰、亮度也較好，說明擴(kuò)增產(chǎn)物就是本研究的目的條帶。

圖1 牛UCP1基因5對引物的電泳圖Figure 1 Electrophoretic map of 5 pairs of primers for cattle UCP1 gene

用Seqman 5.01軟件把試驗牛序列拼接成一條長912 bp的序列，用MEGA 5.5軟件計算出3種不同牛群體中A、T、C、G四個堿基的比例，結(jié)果見表2，可以看出從西藏牦牛、西藏黃牛和通江黃牛的T+A的比值依次減小，而C+G的比值依次增大。3個牛群體遺傳多態(tài)性的分析發(fā)現(xiàn)有3個同義突變和5個錯義突變，分別是 g.443A＞C、g.3593G＞A、g.4873G＞A、g.4963C＞T 和 g.6413A＞G，結(jié)果見圖 2、表 3 和表4。g.443A＞C的突變導(dǎo)致該位點谷氨酸變成了丙氨酸；g.3593G＞A位點的堿基突變導(dǎo)致精氨酸變成賴氨酸；g.4873G＞A位點的G變成A導(dǎo)致該位點的纈氨酸變成了異亮氨酸；g.4963C＞T位點的堿基突變導(dǎo)致組氨酸變成酪氨酸；g.6413A＞G位點的堿基突變導(dǎo)致谷氨酰胺變成精氨酸。西藏牦牛中檢測到4個錯義位點發(fā)生變異：g.443A＞C、g.3593G＞A、g.4873G＞A 和 g.6413A＞G，其中 g.4873G＞A 和 g.6413A＞G 位點有3種基因型，g.3593G＞A位點有GG和AG 2種基因型，而g.443A＞C位點只有CC 1種基因型；西藏黃牛中檢測到2個錯義位點發(fā)生變異：g.443A＞C和g.6413A＞G，2個位點均有3種基因型；通江黃牛中僅檢測到 2 個錯義位點：g.443A＞C 和 g.4963C＞T，這2個變異位點均包括3種基因型。

圖2 牛UCP1基因編碼區(qū)5個位點的突變Figure 2 Mutation of 5 loci in the coding region of bovine UCP1 gene

表2 西藏牦牛、西藏黃牛和通江黃牛UCP1核苷酸序列的組成Table 2 Nucleotide composition of UCP1 gene sequences in Tibetan yak、Tibetan cattle and Tongjiang cattle

表3 牛UCP1基因編碼區(qū)氨基酸變化Table 3 Amino acid changes in the coding region of bovine UCP1 gene

2.2 UCP1基因外顯子5個錯義突變位點基因型及等位基因頻率的分布

本文統(tǒng)計了3個牛群體5個錯義突變位點基因型和等位基因頻率（見表4）。g.443A＞C位點在3個牛群中C等位基因為優(yōu)勢等位基因，在西藏牦牛C等位基因的頻率為100%，西藏黃牛中為78.3%，通江黃牛中為 69.2%；c.3593G＞A 位點在西藏牦牛中AG基因型為優(yōu)勢基因型，占93.3%，在西藏黃牛和通江黃牛中所有個體基因型都為GG；西藏牦牛在c.4873G＞A位點AA基因型為優(yōu)勢基因型，占 93.4%，西藏黃牛和通江黃牛在c.4873G＞A位點的等位基因型均為GG；c.4963C＞T位點西藏牦牛和西藏黃牛的等位基因都為C，通江黃牛C等位基因為優(yōu)勢等位基因，占60%；c.6413A＞G位點的G等位基因頻率隨著群體所處海拔的降低而降低，西藏牦牛的G等位基因頻率為88.3%，西藏黃牛的為29.2%，通江黃牛為0。

表4 牛UCP1基因編碼區(qū)5個突變位點的等位基因和基因型頻率Table 4 Frequencies of genotypes and alleles at 5sites in coding region of cattle UCP1 gene

2.3 UCP1基因5個錯義突變與3個牛群體分布位點的關(guān)聯(lián)分析

本文對牛UCP1基因的5個錯義突變的SNPs位點,即 g.443A＞C、g.3593G＞A、g.4873G＞A、g.4963C＞T和g.6413A＞G，分別進(jìn)行卡方獨(dú)立性檢驗（見表 5），分析各位點基因型與?？购缘南嚓P(guān)性。結(jié)果表明，5個位點的基因型在不同群體中差異極顯著（P＜0.0001），因此推測 g.443A＞C、g.3593G＞A、g.4873G＞A、g.4963C＞T 和 g.6413A＞G 位點均可能與牛的抗寒性存在一定的相關(guān)性。

表5 UCP1基因5個位點變異與抗寒性的相關(guān)分析結(jié)果Table 5 Association between genotype of UCP1 gene SNPs and cold resistance

3 討論

探明高原牛產(chǎn)熱的分子遺傳機(jī)制是抗寒性新品系牛的重要基礎(chǔ)。大量研究結(jié)果表明，UCP1敲除的小鼠棕色脂肪細(xì)胞完全缺乏腎上腺素介導(dǎo)的生熱[14]。J.Nedergaard等研究發(fā)現(xiàn)UCP1是適應(yīng)性腎上腺素非震顫性生熱的唯一調(diào)停者，沒有其他蛋白或新陳代謝途徑能調(diào)節(jié)這一過程[15]。這些研究結(jié)果說明了UCP1基因可能影響了動物的產(chǎn)熱代謝，進(jìn)而影響動物對環(huán)境溫度有不同的適應(yīng)性，為本研究的開展提供了重要的理論依據(jù)。李維等發(fā)現(xiàn)家兔UCP1基因外顯子區(qū)C232T和內(nèi)含子區(qū) T332C、T550C、A560G 4個位點變異與肌內(nèi)脂肪沉積相關(guān)聯(lián)[16]。C.F.Nicoletti等研究表明，在人體內(nèi)UCP1的等位基因A3826G位點的多態(tài)性與體脂有關(guān)[17]。寒冷環(huán)境刺激不僅促進(jìn)BAT增殖，而且使WAT發(fā)生棕色化改變[18]，棕色脂肪的主要功能是產(chǎn)熱保溫，脂肪對哺乳動物的抗寒有很大的影響。從這些研究結(jié)果可以看出，UCP1基因影響動物對環(huán)境溫度的不同適應(yīng)性的機(jī)理，可能是其影響了機(jī)體體脂代謝途徑。

朱蔚等研究結(jié)果表明（C+G）%的含量越高的動物越適合在溫度高的環(huán)境中生活，反之亦然[19]，與本文3個牛群體不同耐寒性結(jié)果一致，（C+G）%的含量在通江黃牛中最高為51.9%，在牦牛中最低為51.8%。在錯義突變的 5個位點中，其中有 g.443A＞C、g.3593G＞A、g.4873G＞A 和 g.4963C＞T 位點的堿基突變導(dǎo)致的氨基酸變化使得該位點氨基酸的疏水性指數(shù)增大，分別為-3.5～1.8、-4.5～-3.9、4.2～4.5 和-3.2～-1.3（負(fù)值表示親水性，正值表示疏水性），在 3個牛群體中，西藏牦牛氨基酸疏水性大于西藏黃牛和通江黃牛的，推測可能是由于其生活環(huán)境溫度所造成。本研究中5個錯義突變位點都與3個生活在不同海拔的牛相關(guān)聯(lián)，443位點C等位基因頻率和6414位點的G等位基因頻率隨牛群體生活海拔高度的降低而降低；在3593位點和4873位點牦牛有生存優(yōu)勢的基因型分別為AG和AA型；4973位點CC基因型是高原牛生存的必要基因型。從進(jìn)化角度上來看，哺乳動物最先開始于依賴于UCP1的非震顫性生熱，而且也只有哺乳動物存在褐色脂肪組織[20]。非震顫性生熱的出現(xiàn)是哺乳動物暴露在寒冷中獲得的生存必需的手段，且非震顫性生熱的存在使得動物能夠度過長期的寒冷情況[21]。進(jìn)一步而言,依賴于UCP1的非震顫性生熱出現(xiàn)使得動物能適應(yīng)更低的環(huán)境溫度，表現(xiàn)在適應(yīng)新的地理位置和功能生態(tài)位如寒冷的夜晚[21]。這也為本試驗中牛耐寒性和UCP1基因相關(guān)性提供了有力依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究采用PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物直接測序的方法獲得3個品種180頭牛UCP1基因的序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)UCP1基因外顯子的5個錯義突變可能與?？购源嬖陉P(guān)聯(lián)。其中在3593位點和4873位點牦牛有生存優(yōu)勢的基因型分別為AG和AA型；4973位點CC基因型是高原牛生存的必要基因型。該結(jié)果表明，UCP1基因可作為影響?？购缘闹餍Ш蜻x基因或與決定抗寒性狀的主效基因連鎖的分子遺傳標(biāo)記，為解析UCP1基因調(diào)控?？购誀畹姆肿舆z傳學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。