梁家充，朱 蘭，孫利民，楊紅遠(yuǎn)，袁躍云，李東江，洪瓊花*

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院/云南省畜禽遺傳資源保護(hù)和種質(zhì)創(chuàng)新工程實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224；2.云南省家畜改良工作站，昆明 650223）

約9000年前，綿羊在近東地區(qū)被馴化后成為人類重要的家畜物種[1]。家畜繁育全球化的生產(chǎn)和競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致了許多本地品種在世界上消失[2]。聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）估計(jì)，世界上已知的綿羊品種中有36%瀕臨滅絕或滅絕[3]。我國(guó)地方綿羊品種豐富，近年來(lái)，由于不合理地引種改良以及對(duì)地方綿羊種質(zhì)資源缺乏保護(hù)，使地方綿羊品種的數(shù)量急劇減少[4]。因此，對(duì)地方綿羊品種的遺傳多樣性進(jìn)行評(píng)估，是中國(guó)綿羊遺傳資源保護(hù)的重要任務(wù)。云南省獨(dú)特的地勢(shì)結(jié)構(gòu)、氣候特征和多民族文化，決定了其具有豐富的生物多樣性資源，是我國(guó)生物多樣性的天然寶庫(kù)。

微衛(wèi)星（simple sequence repeat，SSR）是廣泛分布于生物體的整個(gè)基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列，一般以2～6 bp的堿基為核心，重復(fù)幾次至幾十次[5]。由于這些標(biāo)記具有高度多態(tài)性、共顯性遺傳性、保守性、基因組豐富性、選擇性中性行為、易檢測(cè)性和高重復(fù)性[6-9]，在品種遺傳多樣性分析、物種遺傳圖譜構(gòu)建和種間遺傳距離估測(cè)等方面具有重要的作用[10]?，F(xiàn)已有多項(xiàng)研究成功地利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)家畜品種間的遺傳多樣性進(jìn)行了描述[11-18]。

本研究采用具有高度多態(tài)的10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，對(duì)云南8個(gè)地方綿羊品種的遺傳多樣性和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行研究，為今后更好地開展資源保護(hù)和種質(zhì)創(chuàng)新提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究實(shí)驗(yàn)羊?yàn)榈蠎c綿羊（DQ）53只、蘭坪烏骨綿羊（LP）59只、寧蒗黑綿羊（NL）60只、石屏青綿羊（SP）64只、騰沖綿羊（TC）61只、昭通綿羊（ZT）52只、麗江綿羊（LJ）60只和云南半細(xì)毛羊（BX）56只，共計(jì)8個(gè)綿羊品種465個(gè)樣本。8個(gè)云南地方綿羊品種的來(lái)源地理分布如圖1所示。抽取每只試驗(yàn)羊5 mL頸靜脈血，置于EDTA抗凝采血管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 8個(gè)云南地方綿羊品種的來(lái)源分布Figure 1 Source distribution of 8 Yunnan native sheep breeds

1.1.2 主要試劑

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA），鹽酸、瓊脂糖、氯化鈉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、溴化乙錠、溴酚蘭和甲醛等購(gòu)自Promega公司；TaqDNA聚合酶和dNTP購(gòu)自Takara生物工程有限公司；血液基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生物有限公司；微衛(wèi)星熒光引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)

選擇的10對(duì)微衛(wèi)星引物序列由FAO提供，引物信息見(jiàn)表1。

表1 10對(duì)微衛(wèi)星引物信息Table 1 10 pairs of microsatellite primers

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

按照試劑盒的使用方法提取465個(gè)樣本血液的DNA。抽提的DNA于-20℃冷凍保存。對(duì)提取的基因組DNA，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察電泳結(jié)果。

1.2.2 微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增檢測(cè)

PCR 反應(yīng)體系 20 μL：2×Taq PCR Mix 10 μL，DNA 模板 1 μL，上、下游引物各 1 μL，用雙蒸水補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，退火（根據(jù)各引物退火溫度，見(jiàn)表1）30 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 5 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和12%聚丙烯酰胺電泳檢測(cè)，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳和基因型測(cè)定。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Popgene 1.31軟件計(jì)算下列遺傳多樣性的指標(biāo)：觀察等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne），觀測(cè)雜合度（Ho），期望雜合度（He），Nei's基因多樣性（H），F(xiàn)-統(tǒng)計(jì)量變異系數(shù)（Fst）和 Shannon-Weaver指數(shù)（I）；應(yīng)用POPGENE軟件通過(guò)Fst進(jìn)行地域的地理分布分析；應(yīng)用程序pic-calc 0.6計(jì)算每個(gè)SSR的辛普森多樣性指數(shù)，也被稱為多態(tài)信息含量（PIC）；使用樣本共有片段的相似矩陣進(jìn)行聚類分析，基因型之間的遺傳關(guān)系用基于數(shù)學(xué)平均數(shù)的非加權(quán)組平均法（UPGMA）確定，用 ntsys2.1軟件實(shí)現(xiàn)；用 STRUCTURE2.3.4計(jì)算 8個(gè)綿羊品種的所屬遺傳群體。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR多態(tài)性變化

用10對(duì)微衛(wèi)星熒光引物進(jìn)行擴(kuò)增的465只羊的PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳，產(chǎn)生4 650個(gè)電泳結(jié)果。部分結(jié)果如圖2所示。熒光毛細(xì)管電泳具有典型性峰形，易于判斷，保證了本試驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

圖2 微衛(wèi)星位點(diǎn)毛細(xì)管峰圖Figure 2 Capillary peak diagram of microsatellite loci

10對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)8個(gè)綿羊品種共計(jì)465份樣本的多樣性分析可檢測(cè)到160個(gè)等位基因，469個(gè)基因型，各遺傳多樣性參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 本研究中使用的10對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)在465份樣本中的遺傳參數(shù)Table 2 The genetic parameters of 10 microsatellite loci in 465 samples

觀察等位基因數(shù)（Na）是基因分化最重要的指標(biāo)之一，與群體、類型和地理位置直接相關(guān)。在465樣本中，每一個(gè)位點(diǎn)的Na值從7到23不等，平均值為16，擴(kuò)增的基因型數(shù)目從15到82不等，平均為46.9。每個(gè)位點(diǎn)的 Ne在 2.121 到 6.355 之間，平均值為4.304。在整個(gè)樣本集里的160個(gè)等位基因中，44個(gè)（27.5%）是稀有的，頻率低于 0.05。Shannon 信息指數(shù)（I）的值從 0.987 到 2.287，平均為 1.745，期望雜合度（He）和觀察雜合度（Ho）分別從 0.529 到 0.844（平均值=0.739），0.319 到 0.741（平均值=0.619）。Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）范圍從 0.529 到 0.843，平均為0.738。相對(duì)于遺傳分化系數(shù)（Fst），這10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)遺傳變異指數(shù)的范圍從0.045到0.194，均值是0.135。本研究每個(gè)微衛(wèi)星的多態(tài)性信息量（PIC）值從 0.481 到 0.829，平均為 0.706，除 SRCRP5為中度多態(tài)基因座外，其余都為高度多態(tài)基因座。

2.2 不同綿羊種群的遺傳多樣性比較

每個(gè)群體的觀察等位基因數(shù)（Na）平均范圍從4.8 到 8.8，平均為 6.775（見(jiàn)表 3）。每個(gè)群體的 Ho各不相同從 0.430 到 0.693，平均為 0.620。平均 I，H，和PIC每個(gè)位點(diǎn)在人群中變化分別從0.916到1.612（平均=1.311），0.485 到 0.722（平均值為 0.640），以及 0.429 到 0.689（平均=0.594）。其中石屏青綿羊（SP）的序列為最低的遺傳參數(shù)值；這一發(fā)現(xiàn)暗示了石屏青綿羊中樣本間密切相關(guān)。騰沖綿羊表現(xiàn)出最高的遺傳多樣性，除了Ho值外，所有其他遺傳參數(shù)都為最高值。

表3 10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)在8個(gè)綿羊品種中的遺傳參數(shù)Table 3 Genetic parameters of 10 microsatellite loci in 8 sheep breeds

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)

Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)見(jiàn)表4，表中P值小于 0.05表示相應(yīng)群體的基因座處于 Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)。由表4可知，騰沖綿羊8個(gè)基因座均處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)；麗江綿羊有4個(gè)基因座處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)；昭通綿羊有3個(gè)基因座處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)；寧蒗黑綿羊，蘭坪烏骨綿羊和迪慶綿羊有2個(gè)基因座處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)；云南半細(xì)毛羊和石屏青綿羊有1個(gè)基因座處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)。

表4 Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)群體各基因座P值Table 4 The Hardy-Weinberg P values of each gene locus in the population

2.4 基于聚類分析的遺傳關(guān)系

由Popgene 1.31軟件計(jì)算的8個(gè)綿羊群體的Nei氏遺傳距離和Nei氏遺傳相似度結(jié)果可以看出（如表5），8個(gè)綿羊群體的Nei氏遺傳距離在0.090 7～0.767 0之間。其中，麗江綿羊和寧蒗黑綿羊的遺傳距離最近，為0.090 7；石屏青綿羊和云南半細(xì)毛羊的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.767 0。這與樣本的地理來(lái)源分布一致（如圖2）。

表5 8個(gè)綿羊群體的Nei氏遺傳距離和Nei氏遺傳相似度Table 5 Nei's genetic identity and genetic distance of 8 sheep population

UPGMA聚類分析結(jié)果如圖3所示，8個(gè)綿羊品種聚為三大分支。麗江綿羊（LJ），寧蒗黑綿羊（NL），蘭坪烏骨羊（LP），石屏青綿羊（SP）和昭通綿羊（ZT）為第一分支；迪慶綿羊（DQ）為第二分支；云南半細(xì)毛羊（BX）和騰沖綿羊（TC）為第三分支。

2.5 云南綿羊的群體遺傳結(jié)構(gòu)

使用 STRUCTURE 2.2.3 軟件，通過(guò)貝葉斯聚類分析，評(píng)估了來(lái)自不同地區(qū)的465個(gè)樣本的群體結(jié)構(gòu)和分化。結(jié)果顯示，當(dāng)遺傳組數(shù)量（K）為8時(shí)，Ln P[D]值達(dá)到最大（圖4A）。由于數(shù)值變化率的ΔK能夠比較準(zhǔn)確地反映真正的K值，所以根據(jù)下列公式：

圖3 8個(gè)綿羊品種的UPGMA聚類圖Figure 3 The UPGMA Cluster graph of 8 sheep breeds

其中 L（K）即 LnP（D），s為標(biāo)準(zhǔn)差，m 為平均值，根據(jù)該公式可計(jì)算得出K與ΔK的折線關(guān)系圖（圖4B）。右圖看出，K=8時(shí)，ΔK達(dá)到最大，表明這465個(gè)樣本分別來(lái)自于8個(gè)種群。

圖4 評(píng)估群體結(jié)構(gòu)和分化Figure 4 Evaluate population structure and differentiation

在 K=8 時(shí)，STRUCTURE 2.2.3 軟件分析作圖（圖5），表明分析組別與樣本實(shí)際來(lái)源相符。

3 討論與結(jié)論

微衛(wèi)星的多態(tài)性能夠反映物種的進(jìn)化歷史，群體中頻率最高的等位基因是該物種中最原始、最保守的，其余的等位基因是進(jìn)化過(guò)程中由該等位基因突變形成的。與許多其他的分子標(biāo)記相比，SSRs有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：它們很豐富，高度多態(tài)，共顯性遺傳，分析簡(jiǎn)單，易于轉(zhuǎn)移。聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAO）建議，在對(duì)家養(yǎng)動(dòng)物進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)時(shí)，每個(gè)品種檢測(cè)的個(gè)體數(shù)量至少應(yīng)達(dá)到25個(gè)個(gè)體，最好達(dá)到50個(gè)個(gè)體以上。在本試驗(yàn)中，每個(gè)群的樣本含量分別都超過(guò)50只，達(dá)到了聯(lián)合國(guó)糧食與農(nóng)業(yè)組織建議檢測(cè)的要求。

3.1 Hardy-Weinberg平衡分析

根據(jù)Hardy-Weinberg法則，在一個(gè)沒(méi)有選擇、突變和遷移的大交配群體中，基因頻率和基因型頻率在世代間保持不變。造成Hardy-Weinberg不平衡的原因可能有近交、雜交、選擇作用、采樣偏差和零等位基因的存在。在本研究結(jié)果中，8個(gè)群體，10個(gè)位點(diǎn)，總計(jì)80個(gè)基因座中，出現(xiàn)13個(gè)基因座表現(xiàn)出不平衡現(xiàn)象。推測(cè)可能造成這種情況的主要原因：一是采樣的群體存在人工選擇影響，群體數(shù)量少，分布相對(duì)集中；二是可能與群體內(nèi)近交有關(guān)，因?yàn)檠蛉猴曫B(yǎng)的母羊較多，公羊少，羊群一般采用就近交配或是可能來(lái)源于同一頭種公羊，群體很難做到隨機(jī)交配，易造成基因丟失。這些都對(duì)群體的基因平衡產(chǎn)生了影響。

3.2 微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性

多態(tài)信息含量（PIC）是衡量片段多態(tài)性的一個(gè)指標(biāo)。D.Botstein等[19]提出了衡量基因變異程度高低的多態(tài)信息含量指標(biāo)，當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，該基因座為高度多態(tài)性，0.5＞PIC＞0.25 時(shí)為中度多態(tài)性，PIC＜0.25時(shí)為低度多態(tài)性。在本研究中的10個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中，DYMS1位點(diǎn)的PIC平均值最高，達(dá)到0.829，SRCRSP5位點(diǎn)的PIC平均值最低，為0.481，其余位點(diǎn)的PIC平均值都在0.807～0.534之間，均為高度多態(tài)性位點(diǎn)。因此，除SRCRSP5基因座多態(tài)信息含量和雜合度均明顯低于其他基因座，不適用于該種群的親緣鑒定和個(gè)體識(shí)別外，其余基因座均有較高的個(gè)體識(shí)別能力，可在相關(guān)鑒定中選用。

3.3 品種內(nèi)遺傳多樣性

PIC是評(píng)估一個(gè)群體遺傳多樣性的重要指標(biāo)。王吉振等[20]利用4個(gè)微衛(wèi)星對(duì)7個(gè)綿羊品種間的遺傳關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各品種的平均PIC值為0.55。常爽等[21]利用9個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析9個(gè)綿羊品種的PIC平均值為0.625。湯存?zhèn)サ萚22]利用10個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)新疆13個(gè)綿羊品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，PIC的平均值為0.680 2。在本研究中的8個(gè)綿羊品種中，騰沖綿羊的PIC平均值最高，平均達(dá)到0.689；石屏青綿羊的 PIC 平均值最低，平均為 0.429，為中度多態(tài)；其余位點(diǎn)的PIC平均值都在0.537～0.656之間，均為高度多態(tài)性，與上述研究結(jié)果相近。表明本研究8個(gè)綿羊品種的遺傳多樣性較為豐富，具有較大的育種潛力，同時(shí)也反映出了當(dāng)前各品種資源的狀態(tài)良好。

期望雜合度（He）又稱基因多樣度，反映各群體在各位點(diǎn)上的遺傳變異，被認(rèn)為是度量群體遺傳變異的一個(gè)最適參數(shù)。平均雜合度的大小可反映遺傳結(jié)構(gòu)變異程度的高低，雜合度越高說(shuō)明該群體內(nèi)的遺傳變異越大，遺傳多樣性也就越豐富；反之則群體內(nèi)的遺傳變異小，遺傳多樣性匱乏。柴文瓊等[23]利用5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記得出5個(gè)品種的觀察雜合度為0.448～0.680。呂慎金等[24]用 30 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記得出 8個(gè)綿羊品種的觀察雜合度為 0.539 0～0.71 35，與之前的研究結(jié)果相近。本研究結(jié)果表明，騰沖綿羊的He平均值最高，為0.729；云南半細(xì)毛羊的He平均值次之，為0.703；石屏青綿羊的He平均值最低，為0.489。說(shuō)明騰沖綿羊遺傳變異最大，遺傳多樣性最豐富，其次是云南半細(xì)毛羊、寧蒗黑綿羊、迪慶綿羊、蘭坪烏骨羊、麗江綿羊和，昭通綿羊，最后是石屏青綿羊。

3.4 系統(tǒng)分化關(guān)系和遺傳結(jié)果

UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，麗江綿羊（LJ）和寧蒗黑綿羊（NL）的遺傳距離相近，與云南半細(xì)毛羊和騰沖綿羊的距離最遠(yuǎn)。麗江綿羊（LJ），寧蒗黑綿羊（NL），蘭坪烏骨羊（LP），石屏青綿羊（SP）和昭通綿羊（ZT）為一大分支；迪慶綿羊（DQ）為一大分支類；云南半細(xì)毛羊（BX）和騰沖綿羊（TC）為另一大分支。結(jié)合圖1的群體來(lái)源地理分布，怒江的蘭坪烏骨羊，麗江的麗江綿羊和寧蒗綿羊地域接近，基因交流機(jī)會(huì)較多，遺傳距離也就越近。而石屏的石屏青綿羊與怒江和麗江的這幾個(gè)品種的綿羊遺傳距離相近，說(shuō)明石屏青綿羊可能曾經(jīng)從該地引種。同樣的可看出昭通綿羊也曾從石屏引種。昭通的云南半細(xì)毛羊?yàn)槿斯づ嘤贩N，遺傳距離和騰沖的騰沖綿羊相近，說(shuō)明云南半細(xì)毛羊可能從騰沖地區(qū)部分引種。而迪慶綿羊在海拔較高的迪慶，與周圍地區(qū)的麗江和怒江的綿羊表現(xiàn)出不同程度的遺傳多樣性，說(shuō)明它們存在一定的地理隔離。

群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，如圖5所示，麗江綿羊和寧蒗黑綿羊群體中對(duì)應(yīng)的顏色有部分交換，說(shuō)明這兩個(gè)群體遺傳距離相近，這與聚類分析的結(jié)果相一致。如圖4B所示，當(dāng)K=8時(shí)，ΔK達(dá)到最大，表明這465個(gè)樣本分別來(lái)自于8個(gè)種群。這與本研究中綿羊樣本實(shí)際采自8群體相符。

本研究結(jié)果表明 SRCRSP1、OarFCB304、OarJMP58、MAF33、DYMS1、ILSTS11、MAF214、CM140、ILSTS28可以作為有效的遺傳標(biāo)記用于綿羊品種的遺傳多樣性和遺傳關(guān)系研究。騰沖綿羊、云南半細(xì)毛羊、寧蒗黑綿羊、迪慶綿羊、蘭坪烏骨羊、麗江綿羊和昭通綿羊都具有較豐富的遺傳多樣性；騰沖綿羊遺傳變異最大，其次是云南半細(xì)毛羊、寧蒗黑綿羊、迪慶綿羊、蘭坪烏骨綿羊、麗江綿羊、昭通綿羊，石屏青綿羊變異最??；它們之間的遺傳分化關(guān)系與品種的地域、起源、馴化和相互引種有關(guān)。