陽明賢，左之才，李 碧，王 宇

（四川農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院/環(huán)境公害與動物疾病四川省高校重點實驗室/動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，成都 611130）

抵抗素是Steppan等在研究胰島素增敏劑——噻唑烷二酮衍生物（thaiazolidiones）的作用機制時，于小鼠脂肪組織發(fā)現(xiàn)的一種特異性小分子蛋白質(zhì)[1]。研究表明，抵抗素可以通過多種途徑拮抗肝臟、骨骼肌和脂肪中胰島素的作用，導(dǎo)致胰島素信號受阻，影響機體糖脂代謝，促進血糖濃度升高，導(dǎo)致胰島素抵抗和2型糖尿病等相關(guān)疾病的發(fā)生及發(fā)展[2-4]。但近年來發(fā)現(xiàn)其在炎癥過程中也扮演著重要角色，是炎癥過程中的重要調(diào)控因子，并與多種促炎因子密切相關(guān)[5-7]，使其成為當前研究熱點。

已有大量研究顯示，在動脈粥樣硬化[8]，肥胖[9]，二型糖尿病[10]等多種疾病過程中，抵抗素均處于高表達水平，但由于缺乏抵抗素原材料，嚴重阻礙進一步探索其在相關(guān)疾病中的作用機制。目前，關(guān)于牛抵抗素基因相關(guān)研究報道較少，且鑒于前期黃建龍[11]等所表達的牛抵抗素未對相關(guān)誘導(dǎo)條件經(jīng)行篩選，大大提高了表達成本，以及蛋白標簽過大易對蛋白原有構(gòu)象產(chǎn)生影響等缺陷，本次實驗選擇原核表達系統(tǒng)，PET系列表達載體，并通過對引物、酶切位點、誘導(dǎo)條件的設(shè)計篩選，不僅實現(xiàn)了牛抵抗素高效可溶性表達的目的，而且為進一步研究蛋白原有生理活性和疾病預(yù)防奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

牛大網(wǎng)膜脂肪組織（采自健康犢牛）；大腸桿菌DH5a，大腸桿菌BL21，大腸桿菌Rosetta（均購自天根生化科技有限公司）；Trizol液，瓊脂糖，焦磷酸二乙酯（DEPC）（均購自 Amresco公司）；乙醇、異丙醇、氯仿、氯化鈣、氯化鈉、鹽酸等（購自萬科公司）；克隆載體 PMD-19-T、Soluion Ⅰ、DNA Marker、Premix Taq酶、反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（均購自TaKaRa公司）；表達載體PET-21a（購自Novagen公司）；酵母提取物（Yeast Extract）、蛋白胨（Tryptone）（均購自O(shè)XOID公司）；鎳柱（購自索萊寶科技有限公司）；內(nèi)切酶XbaI、XhoⅠ酶；質(zhì)粒DNA快提試劑盒、膠回收試劑盒，TE，溶菌酶等（均購自生工生物工程有限公司）。

1.2 引物設(shè)計

按照引物設(shè)計原則，采用Premier 5.0引物設(shè)計軟件，根據(jù)Genbank中牛抵抗素基因序列（NM-183362.1）設(shè)計擴增引物。上游引物5′端帶GC保護性堿基和XbaI酶切位點，下游引物5′端帶XhoI酶切位點。預(yù)擴增抵抗素基因片段327 bp（終止密碼子不擴增），由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。表達氨基酸為 109（RETN）+4（XbaI、XhoI）+6（組氨酸標簽His-tag）個。引物序列如下（酶切位點畫線標記）：

P1，5′-GCTCTAGAATGAAGGCTCTCTCCTTC

P2，5′-CTCGAGCTGGATATGCAGGCG

1.3 總RNA提取及基因擴增

取凍存于液氮中脂肪組織150～200 mg，采用Trizol法提取總RNA。電泳檢測提取效果后，保存于-80℃冰箱。以提取的總RNA為模板，采用試劑盒中隨機引物為模板構(gòu)建cDNA文庫（方法參照說明書）。以cDNA為模板，通過引物P1/P2，擴增得到目的基因，瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目的基因片段，PCR 反應(yīng)體系 25 μL：ddH2O 8.5 μL，cDNA 2 μL，上下游引物均 1 μL，Premix Taq 12.5 μL。同時 PCR產(chǎn)物進行基因測序。將回收片段連接至PMD-19-T載體。體系：PMD-19-T載體1 μL，純化后的PCR產(chǎn)物 2 μL，ddH2O 加至 5 μL，Solution I 5μL。條件：16℃反應(yīng)30 min。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5a感受態(tài)細胞，抽提質(zhì)粒送生工公司測序，測序序列同牛抵抗素基因（NM-183362.1）比對，確定已得到正確牛抵抗素基因。

1.4 重組質(zhì)粒構(gòu)建

表達載體PET-21a、PMD-19-T-RETN質(zhì)粒用XhoⅠ、XbaⅠ進行雙酶切，并用凝膠快速回收試劑盒回收基因片段。體系（50 μL）：XhoⅠ、XbaⅠ各2.5μL、10×QuickCutBuffer5μL、載體PET-21a40μL，37℃酶切1h。T-RETN質(zhì)粒酶切方法同PET-21a。利用T4DNA連接酶將酶切回收后的RETN與表達載體 PET-21a 相連。體系（10 μL）：PET-21a 2 μL、RETN 5.5 μL、T4DNA 連接酶 0.5 μL、10 × T4DNA Ligase Buffer 1 μL、PEG 4000 1 μL，22 ℃保溫 1 h。將產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5a，從含有氨芐青霉素抗性的LB平板上通過藍白斑篩選，擴大培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒進行雙酶切鑒定，將酶切結(jié)果正確的陽性菌株送樣測序，基因比對，最終確定成功構(gòu)建重組表達載體PET-21a-RETN。

1.5 重組蛋白誘導(dǎo)條件篩選

將經(jīng)酶切和測序鑒定后的陽性克隆質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)BL21、Rosetta菌株，培養(yǎng)過夜后按1%的體積加入10 mL LB培養(yǎng)基中，于恒溫搖床將其培養(yǎng)至OD600為0.8時，本實驗通過控制變量和設(shè)置對照原則，在其他條件不變情況下，依次改變不同宿主菌（BL21、Rosetta），不同 IPTG 濃度（0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L），不同誘導(dǎo)溫度（20、25、30、35 ℃），不同誘導(dǎo)時間（10、12、14、16 h）等誘導(dǎo)表達條件進行篩選，通過全菌液SDS-PAGE檢測，分離膠體積分數(shù)為15%，濃縮膠體積分數(shù)為5%，判定蛋白表達量，探究重組蛋白最佳表達條件。

1.6 重組蛋白可溶性誘導(dǎo)

溫度是影響蛋白表達形式的最主要因素，在已確定最佳IPTG濃度、誘導(dǎo)時間、宿主菌條件下于不同溫度誘導(dǎo)表達。用20 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）重懸菌體，冰浴超聲破碎菌體，超聲條件：破碎5 s，間歇5 s，功率33%，工作10 min，于4 ℃，10 000 r/min離心15 min，收集上清，沉淀按包涵體純化步驟進行，上清、包涵體進行SDS-PAGE分析，判定蛋白可溶性表達。

1.7 重組蛋白純化

根據(jù)重組蛋白帶有His標簽，收集細菌破碎后上清，通過鎳柱進行蛋白純化，結(jié)果經(jīng)行SDSPAGE實驗分析蛋白純化效果。

2 結(jié)果

2.1 牛抵抗素基因片段的擴增與克隆

以提取的經(jīng)檢測合格的總RNA為模板，經(jīng)PTPCR反應(yīng)擴增，瓊脂糖電泳發(fā)現(xiàn)一條約327 bp的特異性條帶（見圖1），與目的片段相符。切膠回收特異性條帶，基因測序，將回收片段與PMD-19-T載體連接，雙酶切鑒定，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有2 692 bp、327 bp大小條帶（見圖2），與預(yù)期結(jié)果相符，經(jīng)基因測序，確定已獲得牛抵抗素基因。

圖1 牛抵抗素基因RT-PCR擴增Figure 1 Bovine resistin gene amplified by RT-PCR

圖2 PMD-19-T-RETN質(zhì)粒雙酶切鑒定Figure 2 PMD-19-T-RETN digested by double enzyme digestion

2.2 RETN重組表達質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

將測序正確后的PMD-19-T-RETN質(zhì)粒、表達載體PET-21a雙酶切，切膠回收目的片段經(jīng)行連接。產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a，抽提質(zhì)粒，雙酶切鑒定出現(xiàn)5 443 bp、327 bp大小條帶（見圖3），與預(yù)期結(jié)果相符，基因測序，結(jié)果正確。確定重組表達質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖3 PET-RETN雙酶切鑒定Figure 3 PET-RETN digested by double enzyme digestion

2.3 重組蛋白誘導(dǎo)條件篩選

在相同條件下分別誘導(dǎo)陽性克隆宿主菌Rosetta、BL21，通過SDS-PAGE檢測全菌蛋白和灰度值分析發(fā)現(xiàn)，Rosetta菌表達情況明顯優(yōu)于BL21菌（圖4），后續(xù)實驗選擇Rosetta菌為宿主菌。分別用終濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L 的 IPTG 在相同條件下陽性Rosetta克隆菌，發(fā)現(xiàn)隨IPTG濃度增加，抵抗素表達量呈上升趨勢，確定最佳IPTG終濃度為1.0 mmol/L（圖5）。分別于 20、25、30、35 ℃，IPTG 終濃度1.0 mmol/L條件下誘導(dǎo)陽性Rosetta克隆菌，實驗結(jié)果顯示溫度對重組蛋白總產(chǎn)量不顯著（圖6）。IPTG終濃度1.0 mmol/L，20℃，分別誘導(dǎo)陽性Rosetta克隆菌 10、12、14、16 h，確定最佳誘導(dǎo)時間 14h（圖7）。

圖4 Rosetta、BL21蛋白表達結(jié)果Figure 4 Expression of recombinant protein in Rosetta and BL21

圖5 不同IPTG濃度誘導(dǎo)重組蛋白表達結(jié)果Figure 5 Expression of recombinant protein at different IPTG concentrations

圖6 不同溫度誘導(dǎo)蛋白表達結(jié)果Figure 6 Expression of recombinant protein at different temperature

圖7 不同時間誘導(dǎo)蛋白表達結(jié)果Figure 7 Expression of recombinant protein at different times

2.4 重組蛋白可溶性條件篩選

陽性克隆Rosetta菌于最佳IPTG終濃度（1.0 mmol/L），最佳誘導(dǎo)時間（14 h），分別于 20、25、30、35℃溫度下誘導(dǎo)，分別收集上清和純化包涵體，SDS-PAGE檢測重組蛋白于上清、包涵體中表達情況，發(fā)現(xiàn)隨著誘導(dǎo)溫度升高，重組蛋白以包涵體形式存在（圖8），而低溫有利于蛋白可溶性表達，確定誘導(dǎo)溫度為20℃。最終實驗確定最佳誘導(dǎo)條件為：IPTG終濃度1.0 mmol/L，誘導(dǎo)溫度20℃，誘導(dǎo)時間14 h，宿主菌Rosetta，此表達條件可得最高可溶性重組蛋白。

圖8 重組蛋白表達形式判定Figure 8 Expression pattern of recombinant protein

2.5 Western Blot鑒定融合蛋白

于已確定最優(yōu)條件下誘導(dǎo)菌體，菌體上清通過免疫印跡（western blot，WB）實驗證實成功誘導(dǎo)表達出可溶性牛抵抗素（圖9）。

圖9 融合蛋白的Western blot分析Figure 9 Western blot analysis of resistin fusion protein

2.6 重組蛋白純化

確定蛋白基本為可溶性表達后，擴增菌液，超聲破碎菌體，收集細胞上清。經(jīng)鎳柱純化，SDS-PAGE實驗證實，已得到純度較高的重組蛋白（圖10）。

圖10 重組蛋白純化鑒定Figure 10 The protein results of purification

3 分析討論

3.1 表達載體及表達系統(tǒng)的選擇

目前，用于外源基因的表達系統(tǒng)主要有真核表達系統(tǒng)，包括昆蟲表達系統(tǒng)、哺乳細胞表達系統(tǒng)；原核表達系統(tǒng)，包括大腸桿菌表達系統(tǒng)、枯草桿菌表達系統(tǒng)。大腸桿菌表達系統(tǒng)研究最早，遺傳背景清楚，與其他表達系統(tǒng)相比，具有操作簡單、周期短、蛋白產(chǎn)量大、抗污染能力強等優(yōu)點[12-13]，是應(yīng)用最廣泛的經(jīng)典表達途徑。常用表達載體主要包括pGEX、pET系列，pGEX系列載體雖對重組蛋白可溶性表達有一定促進作用，但操作復(fù)雜，為避免融合標簽過大對重組蛋白構(gòu)象及生物活性造成影響，需切除蛋白融合標簽，且蛋白純化難以控制，相較于pGEX系列表達載體，pET系列載體所帶的his標簽只有6個組氨酸，分子量小，對蛋白的折疊、構(gòu)象、功能幾乎沒影響，不需切除重組蛋白標簽，操作簡單、表達量大、易于純化[14-15]。因此，本次實驗選擇原核大腸桿菌表達系統(tǒng)、pET21a表達載體。

3.2 誘導(dǎo)條件的篩選

在誘導(dǎo)重組蛋白表達的過程中，宿主菌、IPTG濃度、溫度、誘導(dǎo)時間均會影響重組蛋白表達的形式和量[16-17]。本實驗對蛋白表達的誘導(dǎo)條件經(jīng)行了探索，在表達蛋白時，Rosetta菌中的表達量明顯高于BL21菌，通過密碼子分析，發(fā)現(xiàn)基因存在許多大腸桿菌稀有密碼子，相較于Rosetta菌，BL21菌缺乏對稀有密碼子的翻譯表達，而Rosetta菌是從BL21衍生而來，能顯著增強帶有大腸桿菌稀有密碼子蛋白的表達量[18]。IPTG作為誘導(dǎo)劑促進重組蛋白表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨IPTG濃度的升高，重組蛋白表達量逐漸增加，但考慮到IPTG對細菌的生長有毒害作用[19]，確定IPTG工作濃度為1.0 mmol/L。溫度是決定重組蛋白的表達形式的重要因素，包涵體雖易于表達，但不是天然構(gòu)象蛋白，不具有生理活性，因此表達出折疊正確的可溶性蛋白非常有必要，有研究顯示在低溫條件下，延長誘導(dǎo)時間，通過降低蛋白的合成速率有利于蛋白可溶性表達[20-23]，實驗中發(fā)現(xiàn)，隨誘導(dǎo)溫度的降低，重組蛋白可溶性表達量增加，當誘導(dǎo)溫度為20℃時，基本為可溶性表達。所表達出的重組牛抵抗素通過SDS-PAGE電泳時，表觀分子量為27 kD左右，大于實際蛋白分子量，這是因為標簽蛋白His-tag是6個連續(xù)的堿性組氨酸，在緩沖液中帶有強烈正電荷，降低蛋白質(zhì)的電泳速率，從而導(dǎo)致表觀分子量變大[24]。

通過本實驗探索，優(yōu)化了該蛋白表達條件，確定在宿主菌Rosetta、IPTG終濃度1.0 mmol/L、誘導(dǎo)溫度20℃、誘導(dǎo)時間14 h條件下，可高效獲得可溶性重組牛抵抗素蛋白。為今后研究牛抵抗素參與相關(guān)疾病的調(diào)控機制和作用受體，以及對相關(guān)疾病的防治奠定了基礎(chǔ)。