鄧喬予，劉沛霖，胡建成，胡林容，楊遠祥

（四川農(nóng)業(yè)大學環(huán)境學院，成都 611130）

隨著我國工業(yè)的不斷發(fā)展，電鍍、地磚、銅鋁材等大量重金屬污染型工礦企業(yè)遍布城鄉(xiāng)。工業(yè)“三廢”排放、高銅殺菌劑、殺蟲劑、化肥不合理使用等導致土壤中銅污染日益嚴重。《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》[1]顯示，當前我國土壤生態(tài)環(huán)境狀況十分嚴峻，16.1%的土壤重金屬污染問題突出。從污染類型來看，主要以無機型為主，而重金屬銅超標情況在總的無機污染物中占到2.1%，因此治理土壤銅污染顯得尤為緊迫。

重金屬污染土壤修復技術(shù)主要分為工程治理法、化學治理法、生物治理法3種[2]?；瘜W和工程治理法在眾多重金屬污染處理中效果較好，但因其處理工藝復雜，成本較高，且處理后土壤自然性狀易遭到破壞，在實際應用中受到很大限制。而生物治理法主要利用微生物、植物和動物進行治理，與前2種方法相比，此方法投資少，管理便利且對環(huán)境破壞性小，受到大量環(huán)境工作者的關(guān)注。利用超富集植物對土壤進行修復已成為目前研究熱點之一[3]，而植物的選擇則成為植物修復技術(shù)的重點。自R.R.Brooks提出超富集植物至今，已有700多種超富集植物被發(fā)現(xiàn)[4]，但這些植物大多存在生長緩慢，生物量低，地上部分生物量較小的問題，難以滿足商業(yè)要求[5]。因此選擇耐受能力強、生長快速、生物量大的植物運用于土壤污染修復已成為彌補超富集植物缺點的另一個突破方向。李致穎等[6-7]發(fā)現(xiàn)，豆科白三葉（Trifolium repens）、禾本科高羊茅（Festuca elata）具有生長迅速、生物量大的特點，兩種植物在銅污染土壤中能正常生長，可能具有一定的銅污染土壤修復能力。有研究表明將富集植物進行混種可以提高富集植物的重金屬積累量，如將假繁縷（Theligonum macranthum）、三葉草（Trifoliumnpratense）混種后，可提高假繁縷鎘積累量[8]；兩種生態(tài)型三葉鬼針草（Bidens pilosa）混種后，可以有效提高鬼針草對鎘的積累能力[9]。

豆科、禾本科植物混種群落因具有經(jīng)濟有效的氮素來源、良好的土壤水分、養(yǎng)分、光資源調(diào)配能力而引起了研究者們的廣泛關(guān)注[10]。目前對豆禾植物混種研究多集中在草地生產(chǎn)性能[11]、豆禾混種比例、刈割強度[12]、群落多樣性、群落穩(wěn)定性[13]等方面，而豆禾植物混種對重金屬的富集特性、抗性等方面鮮有報道。

本研究采用豆禾混種方式，以白三葉和高羊茅為研究對象，采用人工控制性盆栽試驗，研究不同濃度銅脅迫下白三葉和高羊茅混種植株抗性及富集特性，以期揭示這兩種植物混種對銅污染土壤的修復潛力，進而為類似植物混種運用于重金屬污染土壤修復研究提供一些參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試植物：高羊茅選用品種為獵狗5號（HoundogⅤ），白三葉選用品種為春茵，以上兩種植物草籽均購買于成都市溫江區(qū)花卉市場。

供試土壤：采自四川農(nóng)業(yè)大學成都校區(qū)試驗地，土壤類型為水稻土。將供試土壤風干、研磨后過3目篩，測定其理化性質(zhì)和重金屬銅的背景值。經(jīng)測定，土壤有機質(zhì)為 11.8 g/kg，堿解氮、有效磷、速效鉀、有效銅和全銅分別為 22.7、20.1、161.0、1.89 和10.34 mg/kg，陽離子交換量（CEC）為 l8.5 cmol/kg，pH 值為 6.8。

供試重金屬：采用 CuSO4·5H2O（AR），由雅安市瑞進特生化試劑門市提供。

1.2 試驗設計

采用人工控制性盆栽試驗。試驗盆口徑為25cm，高度為30 cm，每盆加入土壤7.0 kg。土壤銅污染處理參考王小玲等[14]方法，將土壤Cu2+濃度設置為 CK（0 mg/kg）、C1（50 mg/kg）、C2（100 mg/kg）、C3（150 mg/kg）、C4（200 mg/kg）、C5（250 mg/kg）、C6（300 mg/kg）等7種處理水平。每種處理3次重復，共21盆。2016年4月15日將每盆土壤用設定濃度的銅溶液浸泡，常溫放置穩(wěn)定1個月后備用。

2016年5月15日開始對試驗植物進行培養(yǎng)。每盆土壤先加入相同量底肥，底肥P、K含量分別為100、150 mg/kg（以 KH2PO4、KCl的形式加入），N 含量為150 mg/kg（以尿素形式加入）。將高羊茅和白三葉草籽按1∶1混種，待幼苗長出后，拔除多余幼苗，每盆留下健壯、生長一致的高羊茅和白三葉幼苗各6株，按常規(guī)管理培養(yǎng)植物80 d。2016年9月2日采集形態(tài)特征幾乎一致且無病害的白三葉和高羊茅完整植株，然后進行相關(guān)指標測定。

1.3 測定指標與方法

葉綠素含量：分別取收集到的完整植株上倒數(shù)第3、第4片完全成熟葉片，每個處理混勻后稱取0.5 g，用10 mL 80%的丙酮浸提過夜，至葉肉組織完全變白時倒出浸提液，再使用80%的丙酮定容至10 mL。以80%的丙酮為空白對照，使用UV-1800型紫外可見分光光度計分別測定浸提液在663、645、470 nm波長處的光密度值，計算各光合色素含量[15]。

可溶性糖含量：分別稱取1.0 g高羊茅和白三葉樣品，加入少許石英砂研磨至勻漿，室溫下靜置30 min，過濾后定容至100 mL，棄去殘渣，使用蒽酮比色法[16]進行測定。

可溶性蛋白含量：稱取高羊茅和白三葉新鮮葉片各 1.0 g，冰浴研磨前加入 pH 為 7.0 的 0.05 mol/L磷酸緩沖液，待研磨成勻漿后，導入離心管中，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min，取上清液作為樣液，采用考馬斯亮藍G-250法進行測定[17]。

重金屬含量：植物樣品分為地上部分和根部兩部分，用蒸餾水將植物樣品沖洗干凈，使用20 mmol/L乙二胺四乙酸鈉（Na2EDTA）交換15 min，去除表面附著的重金屬離子，并用去離子水洗凈。使用吸水紙將水分吸干后，將植物樣品在105℃下殺青30 min，在75℃下烘干至恒重后，測定其生物量。將樣品粉碎，過100目尼龍篩。稱取0.1g植物樣品，加入10mL混酸（優(yōu)級純硝酸-高氯酸=4∶1），浸泡封口過夜，次日于電熱板上加熱消煮，直至消煮液澄清透明，用去離子水定容至50 mL，用原子吸收分光光度法進行測定，結(jié)果以mg/kg表示[18-19]。

各富集特征指標計算公式為：

植物銅積累量/（mg/kg）=各部分銅含量/各部分生物量

轉(zhuǎn)運系數(shù)TF=地上部銅含量/地下部銅含量

富集系數(shù)BCF=地上（下）部銅含量/土壤銅含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理，SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用最小顯著差數(shù)法（LSD，P＜0.05）進行顯著性差異檢驗，使用Origin9.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 銅脅迫對兩種植物葉綠素的影響

如圖1所示，隨著銅濃度的增加，兩種植株的葉綠素含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。白三葉的葉綠素在銅濃度為C3時葉綠素含量達到最大值1.75 mg/g，較對照組高出59%；高羊茅在C2時葉綠素含量達到最大值1.85 mg/g，高出對照組37.04%。當處理濃度為C5時，對白三葉和高羊茅葉綠素含量的影響較大，其含量分別僅為對照組的72.72%、55.56%?？梢姡瑑煞N植物在銅濃度范圍為CK～C4時具有良好的耐受性，且低濃度的銅對兩種植物葉綠素的合成有促進作用。

圖1 銅迫對兩種植物葉綠素含量的影響Figure 1 Effects of Cu stress on Chl content of two plants

2.2 銅脅迫對兩種植物可溶性糖的影響

從圖2可見，兩種植物的可溶性糖含量隨著銅濃度增加呈現(xiàn)下降的趨勢，但變化差異不大（P＞0.05）。銅濃度為C1、C2時的可溶性糖含量與CK并無顯著性差異（P＞0.05），銅濃度上升至 C6 時的可溶性糖含量與濃度為C1處于同一水平，僅僅略低于對照組水平。因此，環(huán)境中銅的含量處在C1至C6之間時，對高羊茅和白三葉混種可溶性糖含量的影響并不大。

圖2 銅脅迫對兩種植物可溶性糖含量的影響Figure 2 Effects of Cu stress on soluble sugar concentration of two plants

2.3 銅脅迫對兩種植物可溶性蛋白的影響

由圖3可知，隨著銅濃度的增加，兩種植物的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)下降趨勢，但差異并不明顯（P＞0.05）。白三葉的可溶性蛋白含量在處理濃度為C1、C2 時與對照組 CK 無顯著性差異（P＞0.05）；銅濃度為C3、C5時可溶性蛋白含量也沒有明顯變化（P＞0.05）。對于高羊茅，其可溶性蛋白含量在處理濃度C3與C5時并無顯著變化（P＞0.05）。由此可見，銅濃度小于C5時，對高羊茅和白三葉可溶性蛋白含量并無顯著影響（P＞0.05），高羊茅和白三葉的混種能較好地在低濃度銅脅迫下正常生長。

圖3 銅脅迫對兩種植物可溶性蛋白含量的影響Figure 3 Effects of Cu stress on soluble protein concentration of two plants

2.4 銅脅迫對銅積累的影響

由圖4可知，白三葉和高羊茅兩種植物地上部分銅積累量分別為 43.82～414.13 mg/kg，41.60～405.07 mg/kg，地下部分銅積累量分別為 49.75～439.23 mg/kg，43.98～430.50 mg/kg。白三葉地上部分和根部隨著銅含量的增加其銅積累量有顯著的提高（P＜0.05），當銅濃度為 C6 時達到最大值，分別為414.13 mg/kg 與 439.23 mg/kg。高羊茅的銅積累量也呈現(xiàn)出與白三葉類似的變化規(guī)律，當銅的處理濃度達到C6時，其地上部分和地下部分的積累量達到最大值分別為 405.07 mg/kg 與 430.50 mg/kg。

圖4 銅脅迫對兩種植物重金屬積累的影響Figure 4 Effects of Cu stress on copper content of two plants

2.5 銅脅迫對富集系數(shù)的影響

如圖5所示，隨著銅濃度增加，兩種植物的地上部分和地下部分都呈現(xiàn)顯著上升的趨勢（P＜0.05）。白三葉和高羊茅在銅濃度為C6時富集系數(shù)達到最大值，其地上部分富集系數(shù)分別為2.03和1.67，根部富集系數(shù)分別為 2.15 和 1.77。當銅濃度為C4時，白三葉和高羊茅地上部分的富集系數(shù)分別為 1.79、1.44，均大于地下部分，表現(xiàn)出富集植物的特征。

圖5 銅脅迫對兩種植物富集系數(shù)的影響Figure 5 Effects of Cu stress on bioconcentration factors of two plants

2.6 銅脅迫對轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響

如圖6所示，當銅濃度小于C4，白三葉和高羊茅的轉(zhuǎn)運系數(shù)呈現(xiàn)明顯上升的趨勢（P＜0.05），并在C4達到最大值1.02。此時兩種植物都達到了富集植物的標準。當處理濃度高于C4時，高羊茅和白三葉的轉(zhuǎn)運系數(shù)逐漸減小，但都接近于1。說明當生存土壤中的銅濃度沒有嚴重影響兩種植物的生理功能時，其體內(nèi)重金屬由根系轉(zhuǎn)運到地上部分的能力較強。

圖6 銅脅迫對兩種植物轉(zhuǎn)運系數(shù)的影響Figure 6 Effects of Cu stress on translocation factors of two plants

3 討論

3.1 銅脅迫對白三葉和高羊茅混種植株抗性的影響

有關(guān)豆禾混種的研究表明，混種可使草地的光合生理生態(tài)特性會得到改善[20-21]。豆禾混種牧草主要從葉片、根系在空間上分布的差異性來提高光資源的利用率，并增強植物光合生理過程[5]。本研究以葉綠素含量的變化為切入點，揭示混種條件對植物光合生理特性的影響。儲玲等[22-23]的研究結(jié)果顯示，白三葉和高羊茅單種時，在低濃度銅脅迫（10 mg/L）下能較好生長，濃度繼續(xù)增高會使植物的生物量顯著降低，葉片發(fā)黃。而本研究發(fā)現(xiàn)，銅脅迫對白三葉和高羊茅混種植株的葉綠素含量影響較小，當銅濃度達到250 mg/L時，葉綠素含量才顯著降低，說明混種條件下植物的耐受能力及合成葉綠素的能力相對于單種有顯著的提高。此外，低濃度的銅（≤100 mg/kg）對兩種混種植物的葉綠素合成有促進作用，這與王艾萍等[24]的研究結(jié)果類似。

過量的銅會嚴重損害植物的細胞結(jié)構(gòu)和細胞膜[25]。處于逆境下的細胞可以通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)可溶性糖含量，來抵抗外界環(huán)境對其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的威脅。可溶性蛋白質(zhì)與調(diào)節(jié)植物細胞的滲透勢有關(guān)，高濃度的可溶性蛋白質(zhì)可幫助維持植物細胞較低的滲透勢，抵抗脅迫帶來的傷害[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著銅濃度的增加，可溶性糖和可溶性蛋白的含量總體呈遞減趨勢，但銅脅迫處理組下兩種物質(zhì)的含量與CK組并無顯著差異，說明在本研究設置的銅脅迫濃度范圍內(nèi)，兩種植物能夠較好生長。

3.2 銅脅迫對白三葉和高羊茅混種植株銅富集特性的影響

崔爽等[28]的研究表明，普通植物地上部分銅平均積累量為10 mg/kg。本研究發(fā)現(xiàn)，在銅脅迫濃度分別為C1～C6時，混種方式可使白三葉地上部分銅積累量分別為普通植物的 4、12、15、28、30、41 倍，高羊茅地上部分銅積累量分別為普通植物的4、12、18、27、29、40 倍，表現(xiàn)出富集植物的特征。

混種可以提高超富集植物對重金屬的吸收，進而加強植物的重金屬累積量[29]。趙達偉[7]的研究表明，當土壤中銅濃度上升到100 mg/kg時，高羊茅和白三葉單種時地上部分的富集系數(shù)都小于1；當土壤中銅濃度上升到400 mg/kg時，高羊茅和白三葉地下部分的富集系數(shù)小于1；總體來看，地下部分富集系數(shù)遠高于地上部分，說明大部分的銅滯留在根系中，沒有向地上部分移動，不能通過收割的方式來減少土壤重金屬污染。而本研究發(fā)現(xiàn)，通過混種方式能使白三葉地上部分富集系數(shù)得到一定提升，且當銅脅迫濃度達到200 mg/kg時植株的轉(zhuǎn)運系數(shù)大于1，說明兩種植物混種使得白三葉根系重金屬銅向地上部分的轉(zhuǎn)移能力得到提高，兩種植物的混種存在一定協(xié)同作用，使其銅富集能力有了顯著提升。

綜上所述，豆禾混種方式會影響植物在重金屬脅迫條件下的抗性與富集特性。將高羊茅和白三葉進行1∶1混種，可使兩種植物對銅脅迫的耐受能力、富集能力及轉(zhuǎn)運能力得到提高，具有一定現(xiàn)實意義；另一方面，高羊茅和白三葉作為兩種常見牧草，其生物量大，生長周期短，克服了超富集植物生物量低、生長速度慢的缺點。因此，采用高羊茅和白三葉1∶1混種，可望在土壤銅濃度＜250 mg/kg的污染區(qū)作為一種適宜的植物修復方式。