字友梅 黃 琰 郭 燕 張 媛 王莉華 呂國慶 吳 隼

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液一病區(qū)，衛(wèi)輝453100)

白血病是一類骨髓中造血干細胞克隆增殖性疾病，常會出現(xiàn)細胞增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等。白血病包括四種亞型：急性淋巴細胞性、急性髓細胞性、慢性淋巴細胞性和慢性骨髓性[1]。據(jù)統(tǒng)計2012年全世界白血病新增病例35.2萬，占所有癌癥病例的2.5%，居第11位；死亡病例26.5萬，占所有癌癥死亡病例的3.2%，居第10位[2]。白血病是中國十大癌癥之一，2012年白血病死亡病例5.2萬，占全球白血病死亡病例的19.7%[3]。白血病的治療是一個亟待解決的重要醫(yī)學問題。研究表明許多草藥及植物果實有利于白血病的治療[4]。熊果苷(對-羥基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷)是一種天然的多酚類物質(zhì)，屬于氫醌葡萄糖苷化合物，具有2種異構體即alpha-熊果苷和beta-熊果苷，首先發(fā)現(xiàn)于熊果干燥的葉子中，是常見的黑色素合成抑制劑，在化妝品行業(yè)被廣泛用作美白成分[5]。除此之外熊果苷還有許多其他的功能，例如殺菌，抗炎等[6]。但alpha-熊果苷在白血病中的作用研究還很缺乏。本研究的主要目的是探究alpha-熊果苷對人急性T細胞白血病細胞TIB-152增殖和凋亡的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞系與主要試劑 急性淋巴細胞白血病細胞系TIB-152購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)。Alpha-熊果苷(分析純)購自Sigma公司。培養(yǎng)基RPMI1640和胎牛血清購自賽默飛世爾科技公司。CCK-8試劑盒來源于日本同仁化學公司。細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V Apoptosis Detection Kit購自美國BD公司。抗B細胞淋巴瘤2(B cell lymphoma 2,Bcl 2)抗體，抗Bcl 2相關蛋白X (Bcl-2-associated X protein,Bax)抗體，抗 Cleaved caspase-3抗體和抗Cleaved caspase-9抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與藥物處理 TIB-152細胞于添加了10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞增殖到約80%時進行傳代。用不同濃度(0、 0.1、 0.2、 0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500 μmol/L)的alpha-熊果苷處理TIB-152細胞48 h后通過CCK-8檢測細胞毒性。后續(xù)實驗TIB-152細胞分為4組：TIB-152 (對照組)；alpha-熊果苷(10、20、50 μmol/L)組。

1.2.2CCK-8檢測細胞增殖 用10、20、50 μmol/L的alpha-熊果苷處理TIB-152細胞后，每天檢測各組細胞的增殖倍數(shù)。首先用培養(yǎng)基將CCK-8溶液稀釋到10%，再用上述溶液制成1×106個/ml的細胞懸液；然后于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，最后檢測450 nm處吸光值，計算細胞增殖倍數(shù)。

1.2.3流式細胞術分析細胞凋亡 用10、20、50 μmol/L的alpha-熊果苷處理TIB-152細胞48 h后檢測細胞凋亡率。首先1×的Binding buffer將待測細胞制成1×106個/ml的懸液。然后用Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)，碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)染色15 min，最后利用流式細胞儀對染色的細胞進行檢測，計算細胞凋亡率。

1.2.4蛋白印跡 在10、20、50 μmol/L的alpha-熊果苷處理TIB-152細胞48 h后，首先用PBS將待測細胞清洗3次，再入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，100℃變性5 min。等量蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉至PVDF膜，然后用5%的BSA封閉1 h，再加入相應的一抗，4℃過夜孵育，第2天加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照并統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。

1.3統(tǒng)計學分析 用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1Alpha-熊果苷對TIB-152的細胞毒性檢測 通過CCK-8檢測不同濃度alpha-熊果苷處理TIB-152后的細胞活力，分析alpha-熊果苷對TIB-152的細胞毒性。圖1B顯示，當alpha-熊果苷處理濃度<50 μmol/L 時，TIB-152的細胞活力可維持在80%以上，未產(chǎn)生明顯的細胞毒性；但當alpha-熊果苷處理濃度>50 μmol/L時，TIB-152的細胞活力急劇下降，均在80%以下。由此可見，<50 μmol/L的alpha-熊果苷對TIB-152沒有明顯的細胞毒性，>50 μmol/L的alpha-熊果苷會對TIB-152產(chǎn)生細胞毒性。

2.2Alpha-熊果苷對TIB-152細胞增殖的影響 為分析alpha-熊果苷對TIB-152細胞增殖的影響，利用CCK-8檢測細胞增殖倍數(shù)。如圖2所示，10 μmol/L的alpha-熊果苷組與對照組細胞增殖倍數(shù)無明顯變化。與對照組相比，50 μmol/L的alpha-熊果苷組細胞增殖倍數(shù)明顯降低(P<0.01)。以上結果說明，alpha-熊果苷可減弱TIB-152細胞增殖。

圖1 Alpha-熊果苷化學結構式(A)和alpha-熊果苷對TIB-152 (B)和正常的PBMC (C)細胞活力的影響Fig.1 Chemical structure of alpha-Arbutin (A) and effect of alpha-Arbutin on cell viability of TIB-152 (B)and normal PBMC cells (C)

圖2 CCK-8檢測細胞增殖Fig.2 Proliferation was detected by CCK-8Note: **.P<0.01 vs.control group.

圖3 流式細胞術檢測細胞凋亡Fig.3 Apoptosis was detected by flow cytometryNote: A.Scatter diagram of flow cytometry；B.Histogram of flow cytometry，**.P<0.01 vs.control group.

圖4 蛋白印跡檢測Bax和Bcl-2表達Fig.4 Expression of Bax and Bcl-2 was tested by Western blotNote: A.Representative graph of Western blot；B.Histogram of Western blot.**.P<0.01 vs control group.

圖5 蛋白印跡檢測Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達Fig.5 Expression of Cleaved caspase-3 and Cleaved caspase-9 was measured by Western blotNote: A.Representative graph of Western blot；B.Histogram of Western blot.**.P<0.01 vs.control group.

2.3Alpha-熊果苷對TIB-152細胞凋亡的影響 通過流式細胞術檢測細胞凋亡率，分析alpha-熊果苷對TIB-152細胞凋亡的影響。由圖3可知，50 μmol/L的alpha-熊果苷組細胞凋亡率顯著高于對照組(P<0.01)。上述結果表明，alpha-熊果苷可增強TIB-152細胞凋亡。

2.4Alpha-熊果苷對TIB-152細胞Bax/Bcl-2 表達的影響 利用蛋白印跡檢測Bax和Bcl-2表達，分析alpha-熊果苷對TIB-152細胞Bax/Bcl-2 蛋白比值的影響。圖4顯示，50 μmol/L的alpha-熊果苷組Bax/Bcl-2比值顯著高于對照組(P<0.01)。由此可見，alpha-熊果苷可提高TIB-152細胞Bax/Bcl-2 蛋白比值。

2.5Alpha-熊果苷對TIB-152細胞Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達的影響 通過蛋白印跡分析alpha-熊果苷對TIB-152細胞Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達的影響。如圖5所示，50 μmol/L的alpha-熊果苷組Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達顯著高于對照組(P<0.01)。以上結果說明，alpha-熊果苷可上調(diào)TIB-152細胞Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達。

3 討論

目前對T細胞白血病的主要治療方法包括：化療、造血干細胞移植、免疫療法、分子靶向治療等[7]。但這些方法都存在一些缺陷，挖掘新的白血病治療藥物具有重要意義。大量文獻報道植物提取物在各類疾病治療中具有積極作用[8-10]。

細胞增殖的不受控是癌細胞的普遍特征。研究表明許多植物提取物都可調(diào)控癌細胞的增殖。有數(shù)據(jù)顯示梓醇(一種環(huán)烯醚萜葡萄糖苷化合物)具有抑制卵巢癌細胞及乳腺癌細胞增殖的功效[11,12]。有研究發(fā)現(xiàn)在白血病HL60細胞中，沙棘提取物可抑制細胞增殖[13]。據(jù)報道肉桂葉提取物可減弱白血病細胞THP-1增殖[14]。熊果苷是目前美白化妝品的主要原料，質(zhì)量濃度一般在0.07～50 mg/L。近年來還發(fā)現(xiàn)熊果苷對癌癥的治療也具有積極作用。有數(shù)據(jù)表明熊果苷可抑制膀胱癌細胞增殖[15]。本文結果顯示，alpha-熊果苷可明顯減弱人急性T細胞白血病TIB-152細胞增殖。

細胞凋亡的受阻是癌癥的主要特征之一。越來越多的研究表明植物提取物在抗癌細胞凋亡方面發(fā)揮著積極作用。有數(shù)據(jù)顯示大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷可提高卵巢癌細胞凋亡[16]。Jin等[17]發(fā)現(xiàn)梓醇可促進膀胱癌細胞凋亡。據(jù)報道TIB-152細胞中，百足草提取物可誘導細胞凋亡[18]。有研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草提取物可誘導白血病HL60細胞凋亡[19]。據(jù)報道熊果苷可促進B16黑色素瘤細胞凋亡[20]。本研究結果顯示，alpha-熊果苷可增強TIB-152細胞凋亡。但有研究顯示熊果苷有保護U937淋巴瘤細胞免于電離輻射誘導的凋亡的作用[21]。這可能是由于熊果苷存在2種同分異構體：α型和β型，這2種同分異構體的不僅在物理化學性質(zhì)方面存在一定的差異，在功能方面也存在差異[22-24]。另一方面可能是由于作用的時間、濃度、細胞系及細胞所處的環(huán)境的不同造成的。

在線粒體介導的細胞凋亡信號通路中Bax、Bcl-2、Caspase-9和Caspase-3都是關鍵性因子[25]。許多植物提取物可影響這些細胞凋亡信號通路相關蛋白的表達。有研究發(fā)現(xiàn)黃柏酮葡萄糖苷及槲皮素-6-C-β-D-吡喃葡萄糖苷均可提高前列腺癌細胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，增強Caspase-3表達[26,27]。據(jù)報道茯苓提取物可提高白血病U937細胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，上調(diào)Caspase-3，Caspase-8和Caspase-9表達[28]。Sung等[29]發(fā)現(xiàn)緊密小鷹芹提取物可提高白血病HL60細胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，增強Caspase-3和Caspase-9表達。本文結果顯示，alpha-熊果苷可提高TIB-152細胞Bax/Bcl-2 蛋白比值，上調(diào)Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達。

本研究表明，在人急性T細胞白血病TIB-152細胞中，alpha-熊果苷可抑制細胞增殖，促進細胞凋亡，提高Bax/Bcl-2 蛋白比值，增強Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9表達。綜上所述，alpha-熊果苷可激活凋亡信號通路抑制人急性T細胞白血病細胞TIB-152細胞增殖，促進細胞凋亡。下一步計劃進行體內(nèi)實驗研究alpha-熊果苷對急性T細胞白血病發(fā)生發(fā)展的影響。