王 童 崔大偉 徐旭劍 孫長貴 戴玉柱 成 軍

(蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生院，蚌埠233000)

病原微生物侵入機(jī)體或自身組織成分發(fā)生改變刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，形成的免疫復(fù)合物(Immune complex,IC)可被機(jī)體的防御系統(tǒng)清除[1]，但在某些病理情況下，體內(nèi)形成的IC不能被及時(shí)清除，引起一系列連鎖反應(yīng)而導(dǎo)致組織損傷[2,3]。因此，檢查組織內(nèi)或體液中循環(huán)免疫復(fù)合物(Circulating immune complexes,CICs)對某些疾病的診斷、病情觀察、療效判斷、預(yù)后評估和發(fā)病機(jī)制研究等具有重要的臨床病理價(jià)值和流行病學(xué)意義[4-6]。

目前，有關(guān)循環(huán)免疫復(fù)合物檢測的方法主要有：(1)針對免疫復(fù)合物整體進(jìn)行測定的抗原非特異性方法[7]以及抗原特異性方法[8]；(2)針對免疫復(fù)合物中抗原進(jìn)行解離測定的抗原特異性方法[9-13]；(3)針對免疫復(fù)合物中抗體進(jìn)行解離測定的抗體特異性方法[14]。然而，這些方法多數(shù)存在特異性差[7]、靈敏度不能滿足臨床診療[7,8,11,14]、適用范圍窄[8-12,14]等不足，尤其是抗體特異性方法文獻(xiàn)報(bào)道甚少且僅能用于特定免疫復(fù)合物中的抗體檢測[14]。因此，我們在通用CIC抗原解離技術(shù)的基礎(chǔ)上[13,15]，采用聚乙二醇(PEG)二次沉淀分離技術(shù)和Gly-HCl緩沖系統(tǒng)建立了一種通用CIC抗體解離技術(shù)，該技術(shù)可以對多種CICs中的抗體進(jìn)行解離，然后采用相應(yīng)的測定方法對CICs中的特異性抗體進(jìn)行檢測，本文以HBsAg免疫復(fù)合物(HBsAg-IC)為例建立CIC抗體解離技術(shù)，并進(jìn)行應(yīng)用評價(jià)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本收集 153例HBV未感染者血清標(biāo)本來自于健康體檢人群(HBsAg,anti-HBs,HBeAg,anti-HBe,anti-HBc陰性)，作為模式1(HBV-M1)；455例HBV感染者血清標(biāo)本，其中，HBsAg,HBeAg,anti-HBc陽性，即HBV-M2 108例；HBsAg,anti-HBe,anti-HBc陽性，即HBV-M3 165例；HBsAg,anti-HBc陽性，即HBV-M4 64例；anti-HBs,anti-HBe,anti-HBc陽性，即HBV-M5 118例；126例HCV感染者，32例HIV感染者，103例糖尿病患者，134例甲狀腺功能亢進(jìn)患者(應(yīng)用評價(jià)組)，以及155例高血脂、高IgG、黃疸等其他疾病類型的血清標(biāo)本(干擾對照組)來自于本院和浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院標(biāo)本庫。

1.1.2主要儀器與試劑 化學(xué)發(fā)光i2000免疫分析儀(美國Abbott 公司)， 3K18低溫高速離心機(jī)(德國Sigma公司)，Imark 酶標(biāo)儀及model 1575洗板機(jī)(美國Bio-Rad公司)，SHA-EA低溫水浴搖床(常州精達(dá)公司)，osmomat 030冰點(diǎn)滲透壓儀(德國Gonotec公司)，PP-50-P11精密pH計(jì)(德國Sartorius公司)?；瘜W(xué)發(fā)光法測定HBV標(biāo)志物、胰島素(INS)、甲狀腺球蛋白(TG)、抗-TG抗體試劑盒(美國Abbott公司)，ELISA檢測HCV核心抗原、抗-HCV抗體、HIV 抗體試劑盒、HIV P24抗原試劑盒(美國Ortho公司)，免疫印跡法測定抗-INS抗體試劑盒(深圳伯勞特公司)。純化HBsAg(3.0 mg/ml)、羊抗-HBsAg多克隆抗體(3.0 mg/ml)(杭州艾康公司)，純化人TG(1 mg)、羊抗-TG多克隆抗體(1.5 mg/ml)、重組HIV 1 P24抗原(1 mg/ml)、重組INS(5 mg/ml)、羊抗-HCV core多克隆抗體(5 mg/ml)、重組HCV核心抗原(1 mg/ml)、羊抗-HIV 1 P24多克隆抗體(4 mg/ml)、羊抗-INS多克隆抗體(0.2 mg/ml)(英國Cambridge公司)。

1.2方法

1.2.1陽性對照 HBsAg-IC、HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC制備：在美國Abbott公司提供的化學(xué)發(fā)光測定HBsAg和anti-HBs試劑盒的線性范圍內(nèi)，按照合適的比例配制HBsAg-IC：用HBV標(biāo)志物均陰性的獻(xiàn)血員混合血清作為稀釋劑，稀釋羊抗-HBsAg多克隆抗體至500 mU/ml，然后加入純化的人血HBsAg直至游離anti-HBs<15 mU/ml、游離HBsAg<1.5 U/ml為止，37℃2 h， 4℃過夜，即形成穩(wěn)定的HBsAg-IC，精確計(jì)算anti-HBs終濃度為473.6 mU/ml，加0.02%proclin 300生物防腐劑后分裝4℃保存?zhèn)溆茫藶殛栃詫φ?；丙型肝炎核心抗原免疫?fù)合物(HCV-IC)、人類缺陷免疫病毒P24抗原免疫復(fù)合物(HIV-IC)、胰島素免疫復(fù)合物(INS-IC)、甲狀腺球蛋白免疫復(fù)合物(TG-IC)制備參照HBsAg-IC方法。上述所有抗原、抗體測定和結(jié)果判斷均按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2PEG二次沉淀分離法 分離劑A、分離劑B、溶解劑配制及二次沉淀分離方法參照文獻(xiàn)操作[13,15]。

1.2.3HBsAg-IC中anti-HBs解離條件的確定

1.2.3.1解離劑配制 依據(jù)與CIC沉淀物混合后pH改變在-0.5～0.5之間時(shí)的最低Gly-HCl濃度配制 0.06 mol/L、pH(1.0,1.4,1.8,2.2)的等滲Gly-HCl緩沖系統(tǒng)作為CIC抗體解離劑，同時(shí)配制與不同pH CIC抗體解離劑等量混合后溶液pH為7.3～7.5且維持等滲狀態(tài)的相應(yīng)濃度Tris溶液為CIC抗體中和劑，用NaCl調(diào)節(jié)滲透壓，并加入0.02%proclin 300作為防腐劑。

1.2.3.2實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 采用PEG二次沉淀分離法沉淀分離HBsAg-IC陽性對照[15]，然后在HBsAg-IC陽性對照分離沉淀物中分別加入0.06 mol/L、不同pH的CIC抗體解離劑，于不同溫度(4℃,15℃,25℃,37℃)、解離時(shí)間(5、8、10、20 min)、解離振蕩頻率(0、20、60、100次/min)、解離后的放置時(shí)間(0、5、10、15 min)進(jìn)行解離，按pH、溫度、解離時(shí)間、解離振蕩頻率、放置時(shí)間，即五因素四水平正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，通過測定解離后的anti-HBs確定最佳解離條件。

1.2.3.3操作步驟 采用PEG二次沉淀分離法分離待測樣本，HBsAg-CIC沉淀兩份，分別用10 μl溶解劑溶解，一份同時(shí)加入70 μl 不同pH的CIC抗體解離劑和70 μl相應(yīng)濃度的CIC抗體中和劑，混勻后測定anti-HBs，其結(jié)果作為空白值；另一份加入70 μl不同pH的CIC抗體解離劑，分別于不同溫度、解離時(shí)間、振蕩頻率進(jìn)行解離，然后加入70 μl相應(yīng)濃度的CIC抗體中和劑，混勻后于不同放置時(shí)間測定anti-HBs，其結(jié)果作為測定值，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。為了保證HBsAg-IC中anti-HBs在解離、測定過程中的穩(wěn)定性、可比性，CIC抗體解離劑及中和后的溶液均維持在等滲狀態(tài)，測定anti-HBs時(shí)均用等體積、相應(yīng)濃度的Tris作為“CIC抗體中和劑”恢復(fù)反應(yīng)體系pH至7.3～7.5及維持等滲狀態(tài)。

1.2.3.4結(jié)果判斷 HBsAg-IC中anti-HBs結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.2.4方法學(xué)評價(jià) 參照文獻(xiàn)[15]，采用HBsAg-IC陽性對照及收集的不同類型血清標(biāo)本對CIC抗體解離技術(shù)的靈敏度、重復(fù)性、特異度、線性、干擾試驗(yàn)、解離率、回收率進(jìn)行評價(jià)，同時(shí)對相關(guān)試劑的穩(wěn)定性進(jìn)行觀察。

1.2.5HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC中抗體解離條件的確定 采用上述方法和步驟分別對HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC中的抗體解離條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，并測定定量項(xiàng)目的平均解離率。參照表1結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)及相應(yīng)抗體測定結(jié)果的Cutoff值判定樣本中是否存在CICs。

1.2.6應(yīng)用評價(jià) 采用本文建立的CIC抗體解離技術(shù)分別對608份HBV感染者和健康體檢者血清標(biāo)本中5種HBV模式的HBsAg-IC、126份HCV感染者的HCV-IC、32份HIV感染者的HIV-IC、103份糖尿病患者的INS-IC、134份甲狀腺亢進(jìn)患者的TG-IC血清標(biāo)本進(jìn)行分離、解離，然后采用相應(yīng)的試劑盒測定解離后的相應(yīng)抗體，并進(jìn)行比較分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、線性相關(guān)分析及抗體檢出率比較由SPSS12.01軟件完成，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，散點(diǎn)圖、直方圖由GraphPad Prisma 5.0軟件完成。

2 結(jié)果

2.1HBsAg-IC中anti-HBs解離條件 五因素四水平的正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，HBsAg-IC中anti-HBs的最佳解離條件為：CIC抗體解離劑pH1.80，15℃解離5～10 min，振蕩頻率>60次/min，加入CIC抗體中和劑后10 min內(nèi)測定；CIC抗體解離劑選擇含0.085 mol/L NaCl、 0.02%proclin 300生物防腐劑、pH1.80的0.06 mol/L Gly-HCl緩沖液，CIC抗體中和劑選擇含0.138 mol/L NaCl、0.07 mol/L Tris、0.02%proclin 300生物防腐劑的水溶液。

表1解離測定CIC中抗體結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

Tab.1CriteriaforclassificationofantibodyafterCICsdissociation

Measurement valueBlank control valueExplanation>Cutoff*CutoffThis pattern did not exist or suggest random error>Cutoff>CutoffIf the measurement value was higher than the blank control value, there were CICs in the sample, and their concentration was determined on the basis of the difference.If the meas-urement value was lower than the blank control value, there were no CICs in the sample

Note：*.The cutoff value was obtained from the manufacturer′s instructions of each specific kit.

表3不同免疫復(fù)合物的抗體解離、測定條件及解離率

Tab.3Antibodydissociation,determinationconditionsanddissociationrateindifferentimmunecomplexeswithCICantibodydissociationtechnique

CICsConditions for dissociationRequirements for determinationMean dissociation rate (%)HCV-ICpH1.80, 15℃, 5-10 min, oscillation frequency>60 times/minAntibody measurement within 10 min after dissociation-*HIV-IC-*INS-IC-*TG-IC42.1%

Note：*.Qualitative test.

表2CIC抗體解離技術(shù)解離HBsAg-IC中anti-HBs的方法學(xué)評價(jià)結(jié)果

Tab.2Methodologicalevaluationofanti-HBsdissociationinHBsAg-ICwithCICantibodydissociationtechnique

MethodologicalparametersResultAnalytical sensitivityChemiluminescence>10 mU/mlReproducibility (CV)High concentration (original)4.38%Intermediate concentration (1∶1)5.31%Low concentration (1∶5)5.97%Assay specificityInterfere control (n=155) 100%Negative control (n=153)100%Dilution linearityRegression equationY=0.64X-0.18Y: actual anti-HBs in CICsX: theoretical anti-HBs Correlation coefficient(r)0.993 2Interference testExtent of interfering0.84% (-1.25%-2.17%)RecoveryRecovery rate95.4% (88.3%-99.5%)Dissociation rateDissociation rate64.3% (56.1%-68.0%)StabilityPrepared HBsAg-IC (positive control)4℃ for>24 monthsCIC separating agent (A,B)25℃ for>24 monthsCIC dissolving agent25℃ for>24 monthsCIC antibody dissociation agent4℃ for 12 monthsCIC antibody neutralizing agent4℃ for>24 months

2.2方法學(xué)評價(jià) CIC抗體解離技術(shù)解離HBsAg-IC中anti-HBs的方法學(xué)評價(jià)結(jié)果見表2。

2.3HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC中抗體解離條件 HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC的解離條件、操作步驟和試劑組成與HBsAg-IC相同，但定量測定TG-IC中抗體的平均解離率與HBsAg-IC的抗體解離率不相同，結(jié)果見表3。

圖1 CIC抗體解離技術(shù)解離HBsAg-IC、HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC中的抗體水平散點(diǎn)圖和檢出率直方圖Fig.1 Scatter plot of antibody level and histogram of antibody detection rate in HBsAg-IC,HCV-IC,HIV-IC,INS-IC,TG-IC with CIC antibody dissociation technique

2.4應(yīng)用評價(jià) 采用CIC抗體解離技術(shù)對608份HBV感染者和健康體檢者5種HBV模式的血清HBSAg-IC進(jìn)行分離、解離，然后測定HBSAg-IC中的anti-HBs，結(jié)果顯示：不同HBV-M模式之間HBSAg-IC中的anti-HBs含量和檢出率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，以HBV-M2的HBsAg-IC中的anti-HBs含量[(65.68±67.86)mU/ml]和檢出率(79.63%)最高，HBV-M1的HBsAg-IC中的anti-HBs含量[(0.08±0.04)mU/ml]和檢出率(0%)最低(P<0.05)(圖1A、B)；對126份HCV感染者的HCV-IC、32份HIV感染者的HIV-IC、103份糖尿病患者的INS-IC、134份甲狀腺亢進(jìn)患者的TG-IC血清標(biāo)本進(jìn)行分離、解離后分別測定相應(yīng)抗體，其CIC中的抗體檢出率分別為34.8%、66.7%、20.0%、14.3%(圖1C)。

3 討論

CIC抗體解離技術(shù)是一種能夠?qū)ICs進(jìn)行沉淀、分離、解離后可直接定量測定特異性抗體的前處理技術(shù)。本研究采用了高滲的PEG二次沉淀分離法[13,15]將CIC從樣本中高效分離出來，然后通過優(yōu)化的CIC抗體解離技術(shù)將CIC中抗體最大程度地解離成游離抗體，最后采用臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行直接測定。超濾、超速離心、免疫磁珠及傳統(tǒng)PEG沉淀法是分離CIC和病毒粒子的四種主要方法[7,16-18]，其中傳統(tǒng)PEG沉淀法易于在實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展，故本實(shí)驗(yàn)采用PEG沉淀分離法。為了排除生物樣本中其他雜蛋白的干擾，本研究采用了多試劑分步驟的方式來分離、解離生物樣本CIC中的抗原和抗體，通過加入適量NaCl提高滲透壓(500～530 osm)的二次沉淀分離法提高了CIC的分離沉淀效率、大大減少其他大分子雜蛋白的共沉淀及游離抗原的吸附對測定結(jié)果的干擾[15]。在解離、測定過程中，采用緩沖系統(tǒng)和等滲的措施避免了各種參與反應(yīng)的試劑成分對CIC中抗體的損傷和破壞，這些影響因素以往一直未受到重視和關(guān)注[7,9-12]，有效地保證了測定結(jié)果的重復(fù)性、可靠性和有效性。該技術(shù)既適用于游離抗體陰性的標(biāo)本，又適用于游離抗體陽性甚至高濃度的標(biāo)本，并且還可以對標(biāo)本中低水平CICs進(jìn)行濃縮分離、解離，達(dá)到提高檢出率的目的。

采用本文建立的CIC抗體解技術(shù)分別對HBsAg-IC、HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC進(jìn)行應(yīng)用評價(jià)：HBV-M1模式為未感染HBV的健康體檢人群，因血清中不存在HBV標(biāo)志物，也不存在HBsAg-IC，因此HBsAg-IC中的anti-HBs結(jié)果均為陰性，該試驗(yàn)說明了CIC抗體解離技術(shù)的特異性良好；HBV-M2、HBV-M3、HBV-M4均為HBV感染模式(游離HBsAg陽性)，HBV-M5為HBV恢復(fù)期或既往感染模式(游離HBsAg陰性)，四種HBV血清標(biāo)志物模式均檢出anti-HBs，以HBV-M2最高，與實(shí)際相符。本技術(shù)在HCV-IC、HIV-IC、INS-IC、TG-IC中的檢測應(yīng)用也得到了較為滿意的結(jié)果，對于部分標(biāo)本CIC中抗體未檢測到，分析可能有以下3個(gè)方面的原因：①患者血清標(biāo)本中不存在CIC；②患者血清標(biāo)本中存在低水平CIC，目前的沉淀分離技術(shù)和測定方法還達(dá)不到靈敏度要求；③其他尚未發(fā)現(xiàn)的原因。這些結(jié)果可能間接反映了患者可能存在不同的臨床表現(xiàn)、病理特點(diǎn)和疾病進(jìn)展或慢性化的特征，將在今后的系列研究中報(bào)道。

由于本文主要對多種抗原形成免疫復(fù)合物中的多克隆抗體進(jìn)行分離、解離和測定，因此這些抗體的解離條件基本相同，對于參與形成免疫復(fù)合物的單克隆抗體及抗體的種類(如IgG,IgM,IgA)在沉淀分離、解離過程有何影響？未作更詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)比較，還有待今后的進(jìn)一步研究探討。

綜上所述，本文建立的CIC抗體解離技術(shù)，有以下幾個(gè)創(chuàng)新點(diǎn)或優(yōu)點(diǎn)：①采用高滲的PEG二次沉淀分離法，提高了樣本中CICs的分離效率，同時(shí)也有效降低了隨CIC共沉淀的游離抗原、抗體等干擾物濃度對CIC中抗體測定的干擾；②在解離、中和、測定過程中，始終保持CIC和所解離的抗體處于等滲環(huán)境，最大程度地減少待測抗體不受損傷，從而保證了測定結(jié)果的穩(wěn)定；③提出采用解離率來評價(jià)解離技術(shù)的性能更客觀、更科學(xué)；④該技術(shù)可以對標(biāo)本中低水平CICs進(jìn)行濃縮分離、解離，對于感染性疾病窗口期和游離抗體陰性的標(biāo)本，提高了CIC中抗體的檢出陽性率，即診斷靈敏度；⑤該技術(shù)適合在臨床免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)開展，對CIC中抗體進(jìn)行定量測定有助于臨床醫(yī)生對疾病的進(jìn)展、預(yù)后做出量化評估。