劉貴廷 楊 柳

(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院胸外科,牡丹江157000)

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，近些年的發(fā)病率及死亡率呈上升趨勢[1]。近些年隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)的深入研究，提出了基因治療的概念。SOX9位于17q24.3-q25.1，在SOX家族中研究最多，是一種與性腺發(fā)育有關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子，近幾年發(fā)現(xiàn)其與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，多種腫瘤中SOX9出現(xiàn)異常表達，如肺癌、前列腺癌等，其表達影響腫瘤發(fā)生發(fā)展[2,3]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是一項可使特定基因表達沉默的新技術(shù)，具有特異性、高效性等特點，在基因功能研究、疾病治療等方面均有廣泛的應(yīng)用[4,5]。有研究發(fā)現(xiàn)，通過RNAi技術(shù)抑制大腸癌中SOX9表達可抑制癌細(xì)胞生長和誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[6]。肺癌中對SOX9的研究發(fā)現(xiàn)，SOX9可能是判斷肺癌預(yù)后的新標(biāo)志物[7]，miR-206可通過靶向抑制SOX9降低肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[8]，但SOX9表達對肺癌細(xì)胞凋亡及機制的影響研究尚未明確。因此，本研究通過RNAi技術(shù)抑制肺腺癌A549細(xì)胞SOX9表達，旨在SOX9對細(xì)胞增殖凋亡影響及機制。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Bibco；DCFH-DA購自美國Sigma；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen；SOX9、HIF-1α、VEGF、p-JAK2、p-STAT3、survivin抗體均購自美國Abcam；CCK8試劑購自Dojindo化學(xué)研究所；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基；酶標(biāo)儀購自美國Thermo；流式細(xì)胞儀購自美國BD。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 肺腺癌A549細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。用含有10%胎牛血清及青鏈霉素雙抗的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞，置于5%體積分?jǐn)?shù)的CO2孵箱中37℃常規(guī)培養(yǎng)。每2 d換液一次。實驗為生長至對數(shù)期的細(xì)胞。

1.2.2細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染 將A549細(xì)胞分為空白對照組(opti-MEM培養(yǎng)基)、陰性對照組(含有Lip-2000的opti-MEM培養(yǎng)基+合成的無干擾作用的siRNA)和si-SOX9組(脂質(zhì)體+合成的干擾SOX9表達的siRNA)。接種生長至對數(shù)期的A549細(xì)胞于6孔板，將配置的siRNA-Lip混合液加入到含有轉(zhuǎn)染液及細(xì)胞的孔中，每孔加入1 ml，于37℃孵箱中培養(yǎng)6 h，換為含血清的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，備用。

1.2.3細(xì)胞活力檢測 調(diào)整轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞濃度，以每孔5 000個細(xì)胞每孔加入100 μl接種于96孔板，每組設(shè)置5個平行孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，加入10 μl的CCK8溶液在每個細(xì)胞孔中，培養(yǎng)箱孵育2 h，在酶標(biāo)儀上讀取各孔的OD值，波長為450 nm。實驗重復(fù)3次。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測 PBS洗滌轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，稀釋后的緩沖液重懸細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106ml-1，取100 μl的細(xì)胞懸液，每個樣本中分別加入5 μl的Annexin V-FITC及10 μl的PI，室溫下避光反應(yīng)15 min，每孔加緩沖液400 μl，輕柔混勻，上機，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。實驗重復(fù)3次。

1.2.5ROS檢測 PBS洗滌轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，每孔細(xì)胞中加入經(jīng)無血清培養(yǎng)基稀釋成1∶1 000的DCFH-DA(終濃度為10 μmol/L)，繼續(xù)避光孵育1 h，不含血清的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測熒光強度，以熒光強度反映ROS在細(xì)胞內(nèi)的水平。實驗重復(fù)3次。

1.2.6Western blot 適量的RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，取50 μg蛋白上樣，經(jīng)12%的SDS-PAGE，電泳后轉(zhuǎn)NC膜，5%脫脂奶粉封膜30 min，分別加入稀釋好的SOX9、HIF-1α、VEGF、p-JAK2、p-STAT3、survivin抗體(皆為1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，洗膜，加入HRP標(biāo)記的抗體(1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h，ECL顯色，X膠片顯影。以GAPDH作為內(nèi)參，分析各蛋白與內(nèi)參GAPDH條帶的灰度比值，作為各蛋白的相對表達量。實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1SOX9表達檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染si-SOX9的A549細(xì)胞SOX9的表達檢測結(jié)果如圖1和表1所示，轉(zhuǎn)染SOX9的siRNA的細(xì)胞中SOX9的蛋白表達顯著降低(P<0.05)，而陰性對照組SOX9的表達與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這說明抑制SOX9表達的A549細(xì)胞構(gòu)建成功。

2.2轉(zhuǎn)染si-SOX9對肺癌細(xì)胞活力和凋亡率的影響 CCK8法檢測各組細(xì)胞活力，結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，si-SOX9組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)，采用Annexin V-FITC/PI雙染法，通過流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示，與陰性對照組比較，si-SOX9組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。見圖2，表2。

2.3轉(zhuǎn)染si-SOX9對肺癌細(xì)胞ROS水平的影響 在轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞中加入DCFH-DA，通過流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞的熒光強度，可反映細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，檢測結(jié)果如表3所示，與陰性對照組比較，si-SOX9組的ROS水平顯著升高(P<0.05)。

圖1 轉(zhuǎn)染si-SOX9的A549細(xì)胞SOX9的表達Fig.1 Expression of SOX9 in A549 cells transfected with si-SOX9

表1轉(zhuǎn)染si-SOX9的A549細(xì)胞SOX9的表達

Tab.1ExpressionofSOX9inA549cellstransfectedwithsi-SOX9

GroupsRelative protein expression of SOX9Blank control group0.425±0.036Negative control group0.437±0.037si-SOX9 group0.074±0.0091)F139.356P0.000

Note：1)P<0.05 vs Blank control group.

圖2 轉(zhuǎn)染si-SOX9對肺癌細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of si-SOX9 transfection on apoptosis of lung cancer cells

表2轉(zhuǎn)染si-SOX9對肺癌細(xì)胞活力和凋亡率的影響

Tab.2Effectofsi-SOX9transfectiononviabilityandapoptosisrateoflungcancercells

GroupsODApoptosis rate(%)Blank control group0.802±0.0611.53±0.12Negative control group0.794±0.0601.59±0.15si-SOX9 group0.513±0.0391)18.26±1.591)F27.575326.190P0.0010.000

Note：1)P<0.05 vs Negative control group.

表3轉(zhuǎn)染si-SOX9對肺癌細(xì)胞ROS水平的影響

Tab.3Effectofsi-SOX9transfectiononROSlevelinlungcancercells

GroupsRelative fluorescence intensityBlank control group37.1±4.3Negative control group39.2±4.9si-SOX9 group98.8±7.411) F113.564P0.000

Note：1)P<0.05 vs Negative control group.

圖3 轉(zhuǎn)染si-SOX9對肺癌細(xì)胞HIF-1α、VEGF表達的影響Fig.3 Effect of si-SOX9 transfection on expression of HIF-1α and VEGF in lung cancer cells

2.4轉(zhuǎn)染si-SOX9對肺癌細(xì)胞HIF-1α、VEGF表達的影響 通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染si- SOX9后的肺癌細(xì)胞中與腫瘤免疫逃逸相關(guān)的基因HIF-1α和VEGF的蛋白表達，結(jié)果如圖3和表4所示，與陰性對照組比較，si-SOX9組HIF-1α和VEGF的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。

表4轉(zhuǎn)染si-SOX9對肺癌細(xì)胞HIF-1α、VEGF表達的影響

Tab.4Effectofsi-SOX9transfectiononexpressionofHIF-1αandVEGFinlungcancercells

GroupsRelative protein expressionHIF-1αVEGFBlank control group0.447±0.0410.219±0.020Negative control group0.458±0.0430.226±0.022si-SOX9 group0.168±0.0191)0.096±0.0101)F62.47648.899P0.0000.000

Note：1)P<0.05 vs Negative control group.

圖4 轉(zhuǎn)染si-SOX9對肺癌細(xì)胞JAK2/STAT3信號通路的影響Fig.4 Effect of si-SOX9 transfection on JAK2/STAT3 signaling pathway in lung cancer cells

表5轉(zhuǎn)染si-SOX9對肺癌細(xì)胞JAK2/STAT3信號通路的影響

Tab.5Effectofsi-SOX9transfectiononJAK2/STAT3signalingpathwayinlungcancercell

GroupsRelative protein expressionp-JAK2p-STAT3survivinBlank control group0.142±0.0150.192±0.0190.689±0.059Negative control group0.133±0.0130.204±0.0210.627±0.051si-SOX9 group0.054±0.0081)0.088±0.0101)0.149±0.0171)F46.06740.603123.355P0.0000.0000.000

Note：1)P<0.05 vs Negative control group.

2.5轉(zhuǎn)染si-SOX9對肺癌細(xì)胞JAK2/STAT3信號通路的影響 通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染si-SOX9后對肺癌細(xì)胞JAK2/STAT3信號通路p-JAK2、p-STAT3及下游相關(guān)基因survivin蛋白表達的影響，結(jié)果如圖4和表5所示，與陰性對照組比較，si-SOX9組p-JAK2、p-STAT3和survivin的蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。

3 討論

SOX家族基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展存在密切關(guān)系，多種腫瘤中有異常表達，一些腫瘤中上調(diào)表達，起癌基因樣作用，促進腫瘤生長和形成，而一些腫瘤中下調(diào)表達，起到抑癌樣作用。如SOX7在胃癌、胰腺癌中表達上調(diào)[9,10]，而在乳腺癌中表達下調(diào)[11]。SOX9是SOX家族一員，也是被研究最多的一員，有研究發(fā)現(xiàn)，SOX9的缺失可引起前列腺癌腹側(cè)發(fā)生發(fā)育障礙和前列腺畸形，而前列腺腫瘤中SOX9的表達上調(diào)，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。宮頸癌中SOX9的表達與ki67表達呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，SOX9表達增加可抑制細(xì)胞增殖，發(fā)揮抑癌基因作用[13]。肺癌細(xì)胞中SOX9的過表達可引起E-鈣黏蛋白表達下調(diào)，而SOX9表達受到抑制后E-鈣黏蛋白表達上調(diào)[14]，這提示SOX9可通過對E-鈣黏蛋白的負(fù)向調(diào)控促進肺癌的侵襲和運動。此外，也有研究指出，miR-185可通過靶向SOX9抑制肺癌細(xì)胞增殖、侵襲[15]。本研究旨在通過RNAi技術(shù)抑制A549細(xì)胞SOX9表達對癌細(xì)胞增殖凋亡、免疫逃逸相關(guān)因子HIF-1α和VEGF表達的影響和機制研究。

以脂質(zhì)體Lip-2000為載體，將針對SOX9特異性靶點的siRNA轉(zhuǎn)染肺腺癌A549細(xì)胞，細(xì)胞中SOX9的表達明顯受到抑制，這提示抑制SOX9表達的A549細(xì)胞構(gòu)建成功。CCK8檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，SOX9表達受到抑制后肺癌細(xì)胞的活力明顯降低，凋亡率增加。ROS是細(xì)胞內(nèi)重要的氧化還原信號分子，影響細(xì)胞的增殖、凋亡、分化等過程，有研究表明，ROS高水平可促進肺癌、卵巢癌等多種腫瘤細(xì)胞凋亡[16,17]，因此可通過提高腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡。本研究結(jié)果顯示，SOX9表達受到抑制后肺癌細(xì)胞ROS水平顯著升高，這提示SOX9可通過提高ROS途徑誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡。有研究顯示，JAK2/STAT3信號通路的活化可調(diào)控VEGF、bFGF等與血管生長相關(guān)因子表達，促進肺癌微血管形成，VEGF表達與HIF-1α密切相關(guān)[18]。VEGF和HIF在腫瘤免疫逃逸方面起了決定性的作用[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，抑制肺癌細(xì)胞JAK2/STAT3信號通路可對癌細(xì)胞生長起抑制作用，且可降低VEGF和HIF-1α的表達[20]。本研究結(jié)果顯示，RNAi技術(shù)抑制A549細(xì)胞SOX9表達后JAK2/STAT3信號通路p-JAK2、p-STAT3和下游相關(guān)基因survivin及VEGF和HIF-1α的表達均明顯降低，這提示抑制肺癌細(xì)胞SOX9表達可通過下調(diào)JAK2/STAT3信號通路降低肺癌發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，利用RNA干擾技術(shù)抑制SOX9基因表達可降低肺癌細(xì)胞活力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低免疫逃逸相關(guān)因子HIF-1α和VEGF表達，作用機制可能是細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高及JAK2/STAT3信號通路的下調(diào)。本研究可能為以SOX9為靶點的肺癌靶向治療提供了一定的理論依據(jù)。