馬小定 唐江紅 張佳妮 崔 迪 李 慧 黎毛毛,* 韓龍植,*

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東鄉(xiāng)野生稻與日本晴多態(tài)性標記的開發(fā)

馬小定1唐江紅2張佳妮2崔 迪1李 慧3黎毛毛3,*韓龍植1,*

1中國農業(yè)科學院作物科學研究所 / 農作物基因資源與基因改良國家重大科學工程, 北京 100081;2重慶師范大學, 重慶 401331;3江西省農業(yè)科學院水稻研究所, 江西南昌 330200

東鄉(xiāng)野生稻是分布于全球最北端的一種普通野生稻, 與亞洲栽培稻基因組差異較大, 目前缺少覆蓋其全基因組的分子標記。本文以東鄉(xiāng)野生稻和日本晴為材料, 通過篩選已有的1017個標記, 并利用東鄉(xiāng)野生稻基因組重測序信息設計的217個InDel標記, 共檢測出203個標記在東鄉(xiāng)野生稻與日本晴間呈現(xiàn)多態(tài)性。這些標記均勻分布于12條染色體, 平均間隔1.9 Mb, 基本覆蓋東鄉(xiāng)野生稻全基因組區(qū)域。通過對秈粳亞種的檢驗分析, 發(fā)現(xiàn)該套多態(tài)性分子標記在東鄉(xiāng)野生稻與粳稻雜交后代群體基因型分析上具有較高的應用價值。本研究結果為發(fā)掘東鄉(xiāng)野生稻的有利基因以及分子標記輔助選擇育種提供了有力的工具。

InDel標記; 基因組重測序; 粳稻

東鄉(xiāng)野生稻于1978年在我國江西省東鄉(xiāng)縣東源鄉(xiāng)被發(fā)現(xiàn), 當?shù)胤Q之為“野禾”, 后經水稻和植物學相關專家鑒定, 確定為普通野生稻[1-2], 而且是迄今為止發(fā)現(xiàn)的分布于全球最北端(28°14￠N)的普通野生稻。東鄉(xiāng)野生稻具有豐富的遺傳多樣性, 而且攜帶耐寒、耐旱、耐貧瘠、廣親和性、野敗育性恢復性、胞質雄性不育、抗病蟲和高產等相關基因, 對水稻基礎研究和產業(yè)發(fā)展有著舉足輕重的作用, 被譽為“野生植物類的大熊貓”[3]。

分子標記是繼形態(tài)標記、細胞標記和生化標記后發(fā)展起來的一種簡單易用的遺傳標記?，F(xiàn)在水稻研究中被廣泛使用的分子標記有簡單序列重復(Simple Sequence Repeat, SSR)標記、插入/缺失(Insertion-Deletion, InDel)標記和單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)標記。SSR標記是根據(jù)廣泛存在于基因組序列中的、由1~6個核苷酸為重復單位組成的串聯(lián)重復序列而設計的分子標記。由于其分布廣泛、多態(tài)性豐富, 在不同作物功能基因組研究中發(fā)揮了重要的作用。InDel標記是指根據(jù)相同位點序列由不同數(shù)目的核苷酸插入或缺失形成的差異而設計的多態(tài)性標記[4]。InDel標記具有基因組差異位點豐富(例如, 日本晴和93-11基因組序列中平均每953 bp就存在1個InDel[5])、染色體位置明確、條帶清晰、結果可靠等優(yōu)點[6-7]。SNP標記是在基因組水平上單個核苷酸的變異引起的DNA序列多態(tài)性, 形式包括單堿基的缺失、插入、轉換及顛換等。SNP標記遺傳穩(wěn)定性高, 位點豐富且分布廣泛, 檢測快速并且容易實現(xiàn)自動化分析[8-10]。但是目前由于檢測方法及成本的限制, 還未被廣泛采用。除了上述分子標記外, 近年來由于測序技術的發(fā)展和成本的降低, 一些研究機構開始使用全基因組測序技術進行起源進化和功能基因組學的相關研究。全基因組重測序是對已知基因組序列的物種進行不同個體的基因測序, 并在此基礎上對個體或者群體進行差異性分析。通過全基因組重測序分析, 可以找到大量的SNP、InDel、結構變異(Structure Variation, SV)和拷貝數(shù)變異(Copy Number Variation, CNV)等位點[11]。

前期, 雖然已有一些研究者利用東鄉(xiāng)野生稻為供體構建了染色體片段置換系, 但是使用的主要是SSR標記, 而且基因組覆蓋不完全[12]。主要是由于東鄉(xiāng)野生稻和亞洲栽培稻基因組存在較大的差異, 多態(tài)性分子標記數(shù)量和質量不佳。本研究以東鄉(xiāng)野生稻和日本晴為材料, 通過篩選現(xiàn)有分子標記, 以及利用東鄉(xiāng)野生稻基因組重測序數(shù)據(jù)設計的InDel標記, 形成一套覆蓋全基因組的、條帶清晰、結果可靠的分子標記, 為東鄉(xiāng)野生稻的基礎研究和育種利用提供有力的遺傳工具。

1 材料與方法

1.1 研究材料

東鄉(xiāng)野生稻取自江西省農業(yè)科學院水稻研究所保存的東鄉(xiāng)野生稻庵家山居群中的C35單株, 日本晴來源于中國農業(yè)科學院作物科學研究所國家種質庫。按照常規(guī)大田種植方法進行東鄉(xiāng)野生稻的種植和栽培稻日本晴育苗移栽。

1.2 基因組重測序

分別從3個東鄉(xiāng)野生稻植株上取幼嫩的葉片, 然后立即在液氮中冷凍并儲存在–80℃冰箱備用。用DNeasy plant mini kit (QIAGEN)試劑盒提取基因組總DNA, 經NanoDrop、Qubit和瓊脂糖凝膠檢測DNA提取的質量和濃度。5 μg DNA用于北京諾禾致源科技股份有限公司(北京)基因組重測序(Illumina HiSeq2500)。測序下機的原始數(shù)據(jù)經過濾, 去除接頭序列和低質量測序數(shù)據(jù)獲得有效數(shù)據(jù)。有效測序數(shù)據(jù)通過BWA軟件[13]比對到參考基因組(ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-28/fasta/ oryza_sativa/dna/), SAMTOOLs軟件[14]檢測長度小于50 bp的小片段InDel, ANNOVAR軟件[15]對檢測出的InDel注釋。

1.3 InDel標記的設計

根據(jù)東鄉(xiāng)野生稻基因組重測序結果, 對比日本晴基因組序列信息(IRGSP-1.0.28版), 以每隔1.5~3.0 Mb的距離在各染色體上查找對應的插入缺失位點, 在位點前后各選擇120 bp序列, 利用Primer Premier 5.0設計引物。引物長度一般在19~30 bp之間,m值控制在(60±1)℃, 產物設計長度110~180 bp。

1.4 DNA提取、PCR擴增及產物檢測

分別從東鄉(xiāng)野生稻和日本晴植株上取新生的嫩葉, 采用常規(guī)CTAB法提取基因組DNA[16]。

PCR體系10 μL包含模板DNA 0.5 μL、10×PCR buffer 1.0 μL、10 mmol L–1dNTPs 0.3 μL、10 μmol L–1正反引物各0.5 μL、DNA聚合酶0.5 U, 用ddH2O補齊至10 μL。PCR程序為94℃ 預變性5 min; 94℃ 30 s, 59℃ 30 s, 72℃ 30 s, 35個循環(huán); 72℃延伸5 min; 16℃保存。

PCR產物加2 μL 6×Loading buffer, 混勻后取3.5 μL于8%聚丙烯酰胺凝膠電泳槽中, 180 V穩(wěn)壓電壓10 min后調電壓至250 V, 再電泳大約70 min, 電泳結束后用銀染法染膠顯色[17]。

2 結果與分析

2.1 多態(tài)性分子標記開發(fā)

針對東鄉(xiāng)野生稻、日本晴和東鄉(xiāng)野生稻/日本晴雜合體(將兩者DNA等量混合, 模擬雜合體基因組DNA)樣本, 利用實驗室現(xiàn)有的661對SSR標記引物和356對InDel標記引物進行多態(tài)性檢測, 獲得有多態(tài)性的標記81 個, 包括42個SSR標記和39個InDel標記, 多態(tài)率為8%。

為了獲得更多的多態(tài)性標記, 對東鄉(xiāng)野生稻進行了基因組重測序, 通過與對照基因組比對, 分別在染色體基因上游、外顯子、內含子和基因下游區(qū)共檢測到373,501個InDel。根據(jù)此結果, 設計了217對InDel標記引物, 經過檢測, 其中122個標記顯示出多態(tài)性, 多態(tài)率為56% (圖1)。綜合以前和本次設計的引物, 共獲得203個東鄉(xiāng)野生稻與日本晴間有多態(tài)的分子標記。每條染色體上分子標記數(shù)目為9~30個, 平均間隔為1.2~2.6 Mb (表1和附表1)。

圖1 多態(tài)性分子標記篩選

1: 東鄉(xiāng)野生稻; 2: 日本晴; 3: 東鄉(xiāng)野生稻/日本晴雜合體; M: 標準分子量。

1: Dongxiang wild rice; 2: Nipponbare; 3: artificial F1hybrid between Dongxiang wild rice and Nipponbare; M: DNA size marker.

表1 各染色體多態(tài)性標記分布

為了方便研究者直觀地查看標記在染色體上的分布, 利用MapDraw (2.1)軟件, 以標記的物理位置為參數(shù)制作了203個多態(tài)性標記在染色體上的分布圖譜(圖2)。由圖譜可知, 標記在染色體上的分布比較均勻, 基本完全覆蓋了12條水稻染色體。

2.2 多態(tài)性分子標記的應用

為檢驗所開發(fā)的多態(tài)性分子標記在其他亞洲栽培稻中的應用價值,隨機選取了59個多態(tài)性分子標記, 以5個秈稻和5個粳稻品種為樣本, 以東鄉(xiāng)野生稻和日本晴為對照檢測(圖 3)發(fā)現(xiàn), 在粳稻品種中有84.7%的基因型與日本晴一致, 11.6%的基因型與東鄉(xiāng)野生稻一致; 在秈稻品種中有73.9%的基因型與東鄉(xiāng)野生稻一致, 13.5%的基因型與日本晴一致。而在檢測到的異于對照基因型數(shù)量中, 秈稻(10.9%)要遠遠高于粳稻品種(1.7%)(表2和附表2)。因此, 如果利用本套多態(tài)性分子標記進行基因型分析, 其在分析東鄉(xiāng)野生稻/粳稻雜交后代群體基因型上的應用價值高于分析東鄉(xiāng)野生稻/秈稻雜交后代群體。

3 討論

分子標記是現(xiàn)代遺傳學和分子生物學研究最常用的技術之一, 隨著技術的發(fā)展, 分子標記的種類也在不斷發(fā)展, 例如SNP、CNV標記等。東鄉(xiāng)野生稻做為一種普通野生稻, 與亞洲栽培稻基因組具有較大的差異。直接利用常規(guī)的SSR標記以及基于秈稻與粳稻設計的InDel標記來研究東鄉(xiāng)野生稻, 或者開展分子標記輔助選擇育種具有一定的局限性。例如, 本研究直接篩選常用的SSR和InDel標記, 僅僅只有8%的引物存在多態(tài)性。因此, 開發(fā)一套覆蓋東鄉(xiāng)野生稻全基因組的, 并且與亞洲栽培稻間存在多態(tài)性的分子標記至關重要。本研究在篩選現(xiàn)有分子標記的基礎上, 利用東鄉(xiāng)野生稻基因組重測序信息設計的InDel標記, 共獲得了203個多態(tài)性分子標記, 均勻分布于12條染色體上, 標記平均間隔1.9 Mb, 可以滿足基因初定位和標記輔助選擇育種的需要。

表2 多態(tài)性標記秈梗亞種基因型鑒定一致性分析

該分析選取了不同省份的5個粳稻(遼鹽241、松粳8、吉粳88、淮稻9號、合系6號)和5個秈稻(黃花占、白玉絲苗、揚稻6號、湘晚秈12號、鄂中5號)品種, 利用59個多態(tài)性標記進行檢測分析。括號中的數(shù)字代表本基因型占總檢測基因型數(shù)目的比例。

Fivecultivars (Liaoyan 241, Songgeng 8, Jigeng 88, Huaidao 9, and Hexi 6) and fivecultivars (Huanghuazhan, Baiyusimiao, Yangdao 6, Xiangwanxian 12, Ezhong 5) were selected for genotype identification by 59 polymorphic molecular markers. The number in parenthesis represents the proportion of current genotype to total detected genotypes.

1: 東鄉(xiāng)野生稻; 2: 日本晴; 3: 遼鹽241; 4: 松粳8; 5: 吉粳88; 6: 淮稻9號; 7: 合系6號; 8: 黃花占; 9: 白玉絲苗; 10: 揚稻6號; 11: 湘晚秈12號; 12: 鄂中5號。

1: Dongxiang wild rice; 2: Nipponbare; 3: Liaoyan 241; 4: Songgeng 8; 5: Jigeng 88; 6: Huaidao 9; 7: Hexi 6; 8: Huanghuazhan; 9: Baiyusimiao; 10: Yangdao 6; 11: Xiangwanxian 12; 12: Ezhong 5.

分子標記的開發(fā)基本上都是基于2個或者多個特定樣本, 因此獲得的分子標記的應用范圍具有一定的局限性。本研究獲得的203個多態(tài)性分子標記是基于東鄉(xiāng)野生稻和日本晴開發(fā)的, 通過對5個秈稻和5個粳稻品種的檢驗, 發(fā)現(xiàn)其在粳稻品種中檢測的基因型84.7%與日本晴一致, 而在秈稻品種中的基因型73.9%與東鄉(xiāng)野生稻一致。如果利用該套分子標記檢測東鄉(xiāng)野生稻與秈稻雜交的后代, 可能會有大約74%的分子標記不能表現(xiàn)出多態(tài)性; 而在檢測東鄉(xiāng)野生稻與粳稻雜交后代中, 大約會有85%的標記表現(xiàn)出多態(tài)性。因此, 該套分子標記在分析東鄉(xiāng)野生稻與粳稻雜交后代群體的基因型上具有較大的應用價值。

附表 請見網絡版: 1) 本刊網站http://zwxb.chinacrops. org/; 2) 中國知網http://www.cnki.net/; 3) 萬方數(shù)據(jù)http:// c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb.aspx。

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Development of molecular markers polymorphic between Dongxiang wild rice andrice cultivar ‘Nipponbare’

MA Xiao-Ding1, TANG Jiang-Hong2, ZHANG Jia-Ni2, CUI Di1, LI Hui3, LI Mao-Mao3,*, and HAN Long-Zhi1,*

1National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement / Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100081, China;2Chongqing Normal University, Chongqing 401331, China;3Rice Research Institute, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang 330200, Jiangxi, China

Dongxiang wild rice is a type of common wild rice () that has the northernmost natural distribution of any wild rice species. The genome of Dongxiang wild rice differs from that of modern cultivated rice varieties (). At present, a set of molecular markers that covers the entire genome of Dongxiang wild rice is lacking. In this study, we used Dongxiang wild rice and therice variety “Nipponbare” as research materials. By screening the existing collection of 1017 SSR and InDel markers and the 217 InDel markers which were designed using Dongxiang wild rice genome resequencing information, we obtained a set of 203 markers polymorphic between Dongxiang wild rice and ‘Nipponbare’, which were relatively uniformly distributed on the 12 rice chromosomes, and basically covered the entire genome, with an average inter-locus distance of 1.9 Mb. Through the genotyping of fiveand fivevarieties, we concluded that those 203 polymorphic molecular markers have a high application value in genotype analysis of Dongxiang wild rice andrice offspring population. These results provide a powerful tool for exploring beneficial genes from Dongxiang wild rice as well as marker-assisted breeding and selection.

InDel marker; genome re-sequencing;rice

2018-07-09;

2018-10-08;

2018-11-06.

10.3724/SP.J.1006.2019.82037

韓龍植, E-mail: hanlongzhi@caas.cn; 黎毛毛, E-mail: lmm3056@163.com

E-mail: maxiaoding@caas.cn

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0100101, 2016YFD0100301), 國家自然科學基金項目(31501287, 31671664), 國家科技支撐計劃項目(2015BAD01B01-1), 中國農業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目, 國家農作物種質資源保護項目(2017NWB036-01, 2017NWB036-12-2), 國家農作物種質資源平臺(NICGR2017-001)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0100101, 2016YFD0100301), the National Natural Science Foundation of China (31501287, 31671664), the National Key Technology Support Program of China (2015BAD01B01-1), the Agricultural Science and Technology Innovation Program of CAAS, the National Crop Germplasm Conservation Project (2017NWB036-01, 2017NWB036-12-2), and the National Crop Germplasm Resources Platform Project (NICGR2017-001).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20181105.1326.016.html