曲存民 馬國(guó)強(qiáng) 朱美晨 黃小虎 賈樂(lè)東 王書賢 趙會(huì)彥 徐新福 盧 坤 李加納,* 王 瑞,*

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砷脅迫下甘藍(lán)型油菜苗期根、下胚軸和鮮重的全基因組關(guān)聯(lián)分析

曲存民1,2,**馬國(guó)強(qiáng)1,2,**朱美晨1,2黃小虎1,2賈樂(lè)東1,2王書賢1,2趙會(huì)彥1,2徐新福1,2盧 坤1,2李加納1,2,*王 瑞1,2,*

1西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院, 重慶 400715;2重慶市西南大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院, 重慶 400715

油菜是修復(fù)土壤重金屬污染的理想作物, 為篩選甘藍(lán)型油菜耐砷性的顯著關(guān)聯(lián)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及相關(guān)候選基因, 本研究以140份不同來(lái)源的甘藍(lán)型油菜自交系為材料, 測(cè)定和利用油菜60K SNP芯片對(duì)正常和砷脅迫條件下的相對(duì)根長(zhǎng)(RRL)、相對(duì)下胚軸長(zhǎng)(RHL)和相對(duì)鮮重(RFW)進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明, 與RRL、RHL和RFW顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)分別為15、20和35個(gè), 單個(gè)SNP位點(diǎn)表型貢獻(xiàn)率分別介于13.31%~24.39%、18.04%~33.82%和20.19%~25.06%之間; 其中在A02、A07和C02染色體上同時(shí)存在與RRL、RHL和RFW顯著關(guān)聯(lián)的LD區(qū)間?；谟筒嘶蚪M信息在LD區(qū)間內(nèi)共篩選到61個(gè)可能與砷脅迫相關(guān)的候選基因, 其中、、、、和等與重金屬吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明,和是與甘藍(lán)型油菜砷離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的重要候選基因。本研究結(jié)果對(duì)于甘藍(lán)型油菜耐砷脅迫機(jī)理的研究、性狀的改良具有重要參考價(jià)值。

甘藍(lán)型油菜; 耐砷性; 全基因組關(guān)聯(lián)分析; 候選基因

隨著工農(nóng)業(yè)和城市化進(jìn)程的發(fā)展, 以及化肥農(nóng)藥的不合理利用, 使我國(guó)農(nóng)田土壤日益惡化。砷是廣泛存在于自然界的一種微量元素, 有劇毒且有致癌作用, 同時(shí)會(huì)抑制植物生長(zhǎng), 從而嚴(yán)重影響作物產(chǎn)量, 且可食部分砷的積累會(huì)對(duì)食物鏈造成污染[1-2]。植物響應(yīng)重金屬元素脅迫的機(jī)制包括阻止和控制重金屬的吸收、體內(nèi)螯合解毒、體內(nèi)區(qū)室化分隔以及代謝平衡等生物學(xué)過(guò)程[3]。在土壤中, 砷主要以砷酸鹽和亞砷酸鹽的形式存在, 在有氧條件下, 植物從土壤中吸收利用的主要是砷酸鹽, 而在厭氧條件下, 亞砷酸鹽的吸收占主導(dǎo)地位[4]。研究表明, 磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Pht)和水通道蛋白的亞家族(NIPs)是砷酸鹽進(jìn)入植物體的主要通道蛋白, 擬南芥中、、、和都是參與As3+吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的重要基因[5-7], 在水稻中,參與側(cè)根對(duì)As3+吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[8];和均具有運(yùn)輸As3+的能力, 過(guò)量表達(dá)后水稻地上部的砷含量顯著受到抑制[9]。然而大多數(shù)植物體內(nèi)對(duì)重金屬的解毒途徑是以谷胱甘肽為還原劑, 在砷酸鹽氧化還原酶類作用下將體內(nèi)的砷酸鹽還原成亞砷酸鹽, 從而降低其毒性[4]。在擬南芥中, 還原酶ATQ1/HAC1突變顯著增加了其對(duì)砷酸鹽的敏感性, 同時(shí)顯著降低了亞砷酸鹽和砷酸鹽的比率, 從而使As3+從根部流出的能力降低[10]。另外, 植物體內(nèi)的金屬硫蛋白(metallotioneins, MTs) 和植物螯合蛋白 (PCs) 等與重金屬形成螯合物質(zhì), 并在ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作用下轉(zhuǎn)移到液泡中, 能夠緩解As3+對(duì)植物細(xì)胞的毒害[11]。同時(shí), 為了應(yīng)對(duì)脅迫, 植物體內(nèi)產(chǎn)生的抗氧化酶(CAT、POD、SOD、APX)及非酶抗氧化劑[谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸(AsA)等]能夠消除自由基, 抵抗ROS對(duì)細(xì)胞的損傷, 同時(shí)會(huì)主動(dòng)積累一些可溶性溶質(zhì), 如可溶性蛋白、可溶性糖等來(lái)降低胞內(nèi)滲透勢(shì), 以保證重金屬脅迫條件下水分的正常供應(yīng), 維持細(xì)胞正常的生理功能[11]。

十字花科植物是用于植物修復(fù)重金屬污染土壤的理想物種[12-13]。油菜作為良好的冬閑田作物, 因具有生長(zhǎng)速度快、生物量高、對(duì)重金屬有較強(qiáng)的耐受性及吸收積累能力等特點(diǎn), 被認(rèn)為是修復(fù)土壤重金屬污染的優(yōu)良作物之一, 但研究主要集中于Cd、Cu、Zn等重金屬離子方面[12,14-15]。此外, 宋俊英等[16]通過(guò)對(duì)不同甘藍(lán)型油菜和芥菜型油菜品種的水培試驗(yàn)篩選獲得砷排異型品種, 證明低濃度的砷脅迫在一定程度上能夠促進(jìn)排異型油菜的生長(zhǎng), 并增加其產(chǎn)量, 但具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步分析。為解析砷脅迫下影響甘藍(lán)型油菜耐砷性的關(guān)鍵位點(diǎn)和候選基因, 本研究對(duì)140份甘藍(lán)型油菜在砷脅迫后的相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)下胚軸長(zhǎng)和相對(duì)鮮重進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析, 確定顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記和候選區(qū)間, 進(jìn)一步篩選控制性狀變異的候選基因, 并通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證候選基因在砷脅迫下表達(dá)的特性, 明確其基本的生物學(xué)功能。本研究為甘藍(lán)型油菜耐砷脅迫的油菜資源的鑒定提供分子標(biāo)記, 對(duì)于砷污染土壤的修復(fù)及砷污染土壤上農(nóng)產(chǎn)品的安全生產(chǎn)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

140份甘藍(lán)型油菜材料(附表1)的遺傳背景來(lái)源廣泛, 其中國(guó)內(nèi)品種131份, 大部分在長(zhǎng)江流域的重慶、四川、湖北、湖南等地種植, 國(guó)外品種9份, 主要在加拿大和德國(guó)種植。上述材料均由西南大學(xué)重慶市油菜工程技術(shù)研究中心保存提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及表型數(shù)據(jù)考察

隨機(jī)選取10份材料, 分別用不同濃度的砷酸鈉溶液(0、2.5、5、7.5、10、15和20 mg L–1)預(yù)處理, 以獲得最佳處理濃度(15 mg L–1)。然后選取每份材料健康飽滿的100粒種子, 共分為2組。以蒸餾水為對(duì)照, 分別將材料播種于培養(yǎng)盤中, 并用保鮮膜封口。將培養(yǎng)盤置培養(yǎng)間, 培養(yǎng)條件為晝夜溫度為25℃, 光照/黑暗時(shí)間為16 h/8 h, 光照強(qiáng)度為100 μmol m–2s–1, 相對(duì)濕度為60%[17]。培養(yǎng)7 d后, 選取每份材料長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗5株照相, 用AdobeScan移動(dòng)應(yīng)用程序讀取根和下胚軸長(zhǎng), 用萬(wàn)分之一天平分別稱量5株幼苗的鮮重和干重。

各表型性狀的相對(duì)值 = 處理組測(cè)定值/對(duì)照組測(cè)定值[18], 其中相對(duì)根長(zhǎng)(relative root length)、相對(duì)下胚軸長(zhǎng)(relative hypocotyl length)和相對(duì)鮮重(relative fresh weight)分別用RRL、RHL和RFW表示。

1.3 供試材料基因型、群體結(jié)構(gòu)及親緣關(guān)系分析

參照盧坤等[19]方法, 利用油菜60K SNP芯片對(duì)140份甘藍(lán)型油菜材料進(jìn)行SNP基因型分析, 最終獲得32,542個(gè)在甘藍(lán)型油菜基因組中具有唯一位置的SNP 標(biāo)記(MAF < 0.05)用于群體性狀的關(guān)聯(lián)分析。

基于貝葉斯數(shù)學(xué)模型, 利用Structure V2.3.4軟件[20]對(duì)140份材料的關(guān)聯(lián)群體進(jìn)行群體結(jié)構(gòu)分析。假設(shè)群體內(nèi)存在的亞群數(shù)目的范圍為1~10, 運(yùn)用該軟件對(duì)每個(gè)值進(jìn)行5次模擬運(yùn)算, 將模擬參數(shù)迭代(length of burn-in period)和蒙特卡羅迭代(markov chain monte carlo MCMC)均設(shè)置為10,000次循環(huán), 并在混合模型下運(yùn)算。最后根據(jù)STRUCTUREV 2.3.4軟件運(yùn)算得到的后驗(yàn)概率值和2個(gè)連續(xù)的后驗(yàn)概率值的變化速率(Δ)來(lái)確定群體中存在的亞群數(shù)目[21]。利用SPAGeDi v1.4 軟件進(jìn)行親緣關(guān)系(kinship)分析, 并計(jì)算親緣關(guān)系值的矩陣(K矩陣)[22]。

1.4 全基因組關(guān)聯(lián)分析與LD區(qū)間分析

參照Wang等[23]方法, 利用R語(yǔ)言程序包的MRMLM (Multi-Locus Random-SNP-Effect Mixed Linear Model)方法進(jìn)行砷脅迫相關(guān)性狀 GWAS分析,參數(shù)設(shè)置均為默認(rèn)值[23-24]。

顯著關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記閾值以1/標(biāo)記數(shù)設(shè)定為1/32,542 = 3.0E–5, 同時(shí)采用Haploview 4.2計(jì)算顯著關(guān)聯(lián)SNP所在染色體上的LD區(qū)間, 設(shè)定HW閾值(Hardy Weinberg-value cutoff)為0.001, 非缺失標(biāo)記的比例為75%, MAF為0.05, 參照盧坤等[19]方法進(jìn)行, 最終以顯著關(guān)聯(lián)的SNP所在的單倍型塊作為候選基因預(yù)測(cè)區(qū)間, SNP標(biāo)記未在單倍型塊內(nèi)的, 則以標(biāo)記兩側(cè)100 kb側(cè)翼序列作為L(zhǎng)D候選區(qū)域, 用于候選基因的預(yù)測(cè)和功能注釋。

1.5 候選基因預(yù)測(cè)與qRT-PCR分析

根據(jù)已知的甘藍(lán)型油菜基因組測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.genoscope.cns.fr/blat-server/cgi-bin/colza/webBlat)信息[25], 篩選獲得LD區(qū)間內(nèi)的候選基因, 利用Geneious 4.8.5軟件進(jìn)行本地BlastP分析, 與擬南芥進(jìn)行BlastP比對(duì)分析的閾值E-value ≤1E–10, 最終以獲得的同源性最高的擬南芥功能基因注釋候選基因功能[19]。

為進(jìn)一步明確候選基因的功能, 利用qRT-PCR方法, 檢測(cè)砷脅迫后候選基因在根、下胚軸和子葉中表達(dá)量變化差異。參照Z(yǔ)hou等[26]方法提取根、下胚軸和葉片總RNA, 合成cDNA和進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增, 反應(yīng)結(jié)束后, 根據(jù)參照基因用2–DDCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量, 3次重復(fù)。候選基因擴(kuò)增的特異性引物源自qPrimerDB數(shù)據(jù)庫(kù)[27](表1)。

表1 候選基因qRT-PCR特異性引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 砷脅迫相關(guān)性狀的表型變異分析

在正常和砷脅迫處理下(表2), 油菜根長(zhǎng)的變異幅度分別介于1.41~15.80 cm和0.61~13.39 cm之間, 變異系數(shù)分別為25.91%和28.91%, 其相關(guān)系數(shù)為0.986 (<0.01); 下胚軸長(zhǎng)變異幅度分別介于2.68~ 7.99 cm和1.75~6.48 cm之間, 變異系數(shù)分別為16.87%和17.79%, 其相關(guān)系數(shù)為0.955 (<0.01); 鮮重變異幅度分別為0.026~0.093 g和0.019~0.087 g之間, 變異系數(shù)分別為21.93%和26.68%, 相關(guān)系數(shù)為0.996 (<0.01), 上述結(jié)果表明, 甘藍(lán)型油菜發(fā)芽期根長(zhǎng)、下胚軸長(zhǎng)和鮮重在砷脅迫后受到不同程度的抑制作用, 以相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)下胚軸長(zhǎng)和相對(duì)鮮重作為油菜受抑制程度的衡量指標(biāo), 其變異系數(shù)分別為31.09%、20.62%和20.27%, 說(shuō)明受砷脅迫后供試材料在萌發(fā)期存在較大的性狀變異。

統(tǒng)計(jì)分析(圖1)表明, 各性狀值均呈連續(xù)性變異, 符合多基因控制的數(shù)量性狀遺傳特點(diǎn), 適于用GWAS方法進(jìn)行有效的基因定位分析。

2.2 耐砷脅迫相關(guān)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析

用MRMLM模型對(duì)60K SNP芯片獲得的基因型數(shù)據(jù)與140份甘藍(lán)型油菜耐砷性指標(biāo)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析(圖2), 共獲得15個(gè)RRL的顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn), 分別位于A02、A03、A04、A05、A06、A07、A08、C02、C03、C05、C06、C07和C08染色體, 單個(gè)SNP可解釋表型變異的17.31%~24.39% (圖2-A和表3); 20個(gè)與RHL性狀顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn), 分別位于A01、A02、A03、A07、C02和C04染色體上, 單個(gè)SNP位點(diǎn)可解釋18.04%~33.82%的表型變異(圖2-B和表3); 35個(gè)與RFW緊密關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn), 分別位于A01、A02、A07、A09、C02、C04和C07染色體上, 其中, 在A02染色體上檢測(cè)到20個(gè)成簇分布, 單個(gè)SNP可解釋表型變異的20.19%~25.06% (圖2-C和表3)。

圖1 砷脅迫下甘藍(lán)型油菜相對(duì)根長(zhǎng)、下胚軸和鮮重的頻次分布

表2 砷脅迫下甘藍(lán)型油菜苗期性狀統(tǒng)計(jì)分析

CRL、CHL和CFW: 正常條件下的根長(zhǎng)、下胚軸長(zhǎng)和鮮重; TRL、THL和TFW: 砷脅迫下的根長(zhǎng)、下胚軸長(zhǎng)和鮮重; RRL、RHL和RFW: 正常與砷脅迫下相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)下胚軸長(zhǎng)和相對(duì)鮮重;**< 0.01。

RL, CHL, and CFW: the length of root, hypocotyl, and fresh weight under normal condition; RL, THL, and TFW: the length of root, hypocotyl, and fresh weight under As stress; RRL, RHL, and RFW: the relative length of root, hypocotyl, and fresh weight under normal and As stress;**< 0.01.

在檢測(cè)到的顯著關(guān)聯(lián)SNP位點(diǎn)中, 在A02、A07和C02染色體上存在與RRL、RHL和RFW重合的LD連鎖區(qū)間, 對(duì)這些區(qū)間的功能注釋表明, 可能存在影響甘藍(lán)型油菜參與響應(yīng)砷脅迫相關(guān)的基因位點(diǎn)。

表3 砷脅迫下甘藍(lán)型油菜相關(guān)性狀的顯著關(guān)聯(lián)SNPs

RRL、RHL和RFW: 正常與砷脅迫下相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)下胚軸長(zhǎng)和相對(duì)鮮重。

RRL, RHL, and RFW: the relative length of root, hypocotyl, and fresh weight under normal and As stress。

圖2 砷脅迫下甘藍(lán)型油菜相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)下胚軸長(zhǎng)和相對(duì)鮮重全基因組關(guān)聯(lián)分析的曼哈頓圖

2.3 響應(yīng)砷脅迫相關(guān)候選基因分析

根據(jù)已公布的油菜“Darmor-”基因組信息[25], 分別將確定的LD置信區(qū)間和未在LD區(qū)間內(nèi)的顯著連鎖SNP標(biāo)記上下游各100 kb側(cè)翼序列作為候選區(qū)間, 通過(guò)本地BlastP將其候選基因蛋白序列比對(duì)到擬南芥中進(jìn)行基因的注釋, 篩選出目標(biāo)基因組區(qū)段內(nèi)與砷相關(guān)的油菜同源基因。結(jié)果共注釋了61個(gè)與重金屬脅迫或代謝相關(guān)的候選基因, 主要包括、、、、、等(表4)。其中在A02染色體上, 與RRL、RHL和RFW均顯著關(guān)聯(lián)的LD區(qū)間(20.77~23.58 Mb)內(nèi)注釋了一個(gè)與重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的候選基因(), 而在A02染色體關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記覆蓋的5.25~13.03 Mb候選區(qū)段內(nèi), 還包括重要候選基因和, 其功能分別為谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-Transferase 16, GST16[28])和種子特異性的水孔通道蛋白(ALPHA-TONOPLAST Intrinsic Protein, TIP3[29]), 以及注釋基因與種子萌發(fā)相關(guān)(ATP-Binding Cassette G25, AtABCG25[30])等。在A07染色體與RRL、RHL和RFW均顯著關(guān)聯(lián)的LD區(qū)間(19.28~23.58 Mb)內(nèi), 共注釋到16個(gè)相關(guān)候選基因(表4), 其中4個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因、、和, 與擬南芥MATE基因家族蛋白為同源基因, 距Bn-A07-p20935217標(biāo)記下游78.98~ 90.77 kb存在3個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因、和D, 與擬南芥(phosphate transporter 1,)為同源基因, 其注釋功能為與砷離子跨膜運(yùn)輸及磷酸鹽離子運(yùn)輸相關(guān)(表4), 為本研究的重要候選基因。同時(shí), 還包括、和等相關(guān)基因的同源基因(表4), 而在C02染色體的LD置信區(qū)間內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)注釋的相關(guān)功能的候選基因。

另外, 候選基因中在A03、A09和C06染色體上存在重要的與重金屬離子相關(guān)的串聯(lián)重復(fù)基因, 其中A03染色體的2個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因和與擬南芥水通道活性蛋白()同源; 在A09染色體的2個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因和與擬南芥()和()為同源基因, 都屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 3個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因、和與擬南芥中的()為同源基因, 具有谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性; C06染色體上的3個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因均與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān), 分別與擬南芥()和()為同源基因, 而和與擬南芥()為同源基因, 具有碳水化合物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性。因此, 本研究為深入解析甘藍(lán)型油菜響應(yīng)砷脅迫的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

2.4 砷脅迫下候選基因的差異表達(dá)分析

通過(guò)qRT-PCR方法分析了LD候選區(qū)間內(nèi)8個(gè)關(guān)鍵候選基因在砷脅迫下的表達(dá)模式(圖3), 這些候選基因在甘藍(lán)型油菜根、下胚軸和葉中具有不同的表達(dá)模式。其中6個(gè)基因家族成員在根中的表達(dá)量顯著高于對(duì)照, 這些基因與砷離子的吸收密切相關(guān)?；蚝驮谙屡咻S中顯著下調(diào)表達(dá), 基因在所有材料中顯著上調(diào)表達(dá), 但葉中均表現(xiàn)為顯著下調(diào)表達(dá), 基因、和可能為油菜響應(yīng)砷脅迫的重要基因。

3 討論

在自然界中, 砷作為一種非必須微量元素, 被認(rèn)為是I級(jí)致癌物, 對(duì)動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和人們的健康產(chǎn)生危害[31]。十字花科植物對(duì)重金屬鎘、鉛、鋅、汞、砷等均具有較強(qiáng)的耐受性, 但對(duì)于甘藍(lán)型油菜響應(yīng)砷脅迫分子機(jī)制的研究相對(duì)缺乏。隨著油菜60K基因芯片開發(fā)及甘藍(lán)型油菜基因組測(cè)序的完成[25], 通過(guò)GWAS分析并結(jié)合基因組信息挖掘油菜重要數(shù)量性狀的候選基因在油菜研究中已成為常規(guī)手段[17,19,32-34]。本研究通過(guò)對(duì)正常和砷脅迫條件下RRL、RHL和RFW 3個(gè)性狀的全基因組關(guān)聯(lián)分析, 共檢測(cè)到67個(gè)顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn), 分別分布在油菜的15條染色體上。其中, A02和A07的關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記分別與Chen等[35]報(bào)道的鎘離子相關(guān)性狀的關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記位點(diǎn)相近, 關(guān)聯(lián)區(qū)間距離分別為202.81 kb和404.37 kb, 很可能為同一位點(diǎn); 其余位點(diǎn)則與本研究的位點(diǎn)未能重疊, 可能與考察的性狀及鑒定的方法存在差異相關(guān)聯(lián), 也可能是由于甘藍(lán)型油菜響應(yīng)鎘和砷脅迫的分子作用機(jī)制存在差異性。

通過(guò)關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記在油菜基因組中的物理位置及確定的關(guān)聯(lián)LD置信區(qū)間, 根據(jù)已公布的甘藍(lán)型油菜“Darmor-”基因組信息[25], 我們共注釋了61個(gè)可能與響應(yīng)耐砷脅迫相關(guān)的候選基因。在植物中, 研究表明磷酸鹽和砷酸鹽采用相同吸收系統(tǒng)[36]。同時(shí), 砷酸鹽主要通過(guò)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Pht)進(jìn)入植物體, 且與磷酸鹽是化學(xué)類似物, 在提高磷酸鹽含量同時(shí)可減少砷的吸收[37-39], 從而降低砷對(duì)油菜的毒害作用。在A07染色體SNP標(biāo)記Bn-A07-p20935217下游78.98~90.77 kb區(qū)域內(nèi)注釋了3個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因、和,與擬南芥()為同源基因, 該基因與砷的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)與磷酸鹽存在緊密關(guān)聯(lián)性[39,40]。此外, 在A06染色體上SNP標(biāo)記Bn-A06-p16406113上游24~2254 bp的區(qū)間內(nèi)篩選到一個(gè)基因, 其擬南芥同源基因?yàn)?)[41-42], 均具有磷酸鹽離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活性。同時(shí)在砷脅迫后,和在根中的表達(dá)量顯著升高, 說(shuō)明這2個(gè)基因可能與砷離子的吸收相關(guān)聯(lián)。另外,在下胚軸中的表達(dá)量也顯著升高, 說(shuō)明該基因可能是砷離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的重要影響因子。

(圖3)

誤差線表示平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(=3); *和**分別表示在0.05和0.01水平上差異顯著。

Error bar represents the standard error of the mean (=3); * and ** indicate significant difference at the 0.05 and 0.01 probability levels, respectively.

植物在受到高鹽、重金屬等脅迫時(shí), 體內(nèi)的植物ATP結(jié)合盒(ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在離子吸收、累積、轉(zhuǎn)運(yùn)和外排過(guò)程中發(fā)揮重要作用[43]。本研究在關(guān)聯(lián)候選區(qū)間內(nèi)注釋的6個(gè)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)的候選基因(、、、、和)分別與擬南芥()、()、()、()、()和()為同源基因。在砷脅迫后, 本研究發(fā)現(xiàn)在葉中的表達(dá)量顯著升高, 而在根和下胚軸中的變化不明顯(圖4), 說(shuō)明該基因可能參與了砷離子的轉(zhuǎn)運(yùn), 其具體的機(jī)理有待進(jìn)一步驗(yàn)證。另外, 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(gluthione S-transferase, GST)是植物體內(nèi)重要的解毒酶類物質(zhì), 也是植物螯合肽(Phytochelatin, PC)合成前體, 對(duì)重金屬有較大的親和力和重金屬離子鰲合能力, 是植物自身解毒機(jī)制形成的重要因子[44]。同時(shí), 高濃度的GSH可提高植物體對(duì)重金屬的耐受能力, 對(duì)植物抗重金屬過(guò)程中的作用進(jìn)行了廣泛研究[45-46], 但是在甘藍(lán)型油菜中的相關(guān)報(bào)道還較少。本研究在A07, A09和C06染色體的關(guān)聯(lián)LD區(qū)間內(nèi)注釋到7個(gè)編碼谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶相關(guān)的候選基因 (、、、、、和)和1個(gè)谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶活性相關(guān)基因()。在砷脅迫下, 本研究中, 除外,、、和在根中顯著上調(diào)表達(dá)(圖4), 說(shuō)明這些基因功能可能與根對(duì)砷離子的吸收相關(guān)聯(lián)。然而在下胚軸中、和在葉中均顯著下調(diào)表達(dá)(圖4), 說(shuō)明它們可能與砷離子的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)及降解相關(guān)聯(lián)。因此, 進(jìn)一步深入開展上述關(guān)聯(lián)候選基因的功能分析將有助于揭示甘藍(lán)型油菜發(fā)芽期適應(yīng)砷脅迫的響應(yīng)機(jī)制, 為甘藍(lán)型油菜重金屬耐受性新品種的選育提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

共獲得70個(gè)油菜砷脅迫性狀相關(guān)的顯著關(guān)聯(lián)SNP標(biāo)記位點(diǎn), 其中與相對(duì)根長(zhǎng)、相對(duì)下胚軸長(zhǎng)和相對(duì)鮮重顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)分別為15、20和35個(gè)。在顯著關(guān)聯(lián)的候選區(qū)間內(nèi)共注釋到61個(gè)砷脅迫相關(guān)的候選基因, 其中和可能是參與甘藍(lán)型油菜砷離子吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的重要候選基因。

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Genome-wide association of roots, hypocotyls and fresh weight at germination stage under as stress inL.

QU Cun-Min1,2,**, MA Guo-Qiang1,2,**, ZHU Mei-Chen1,2, HUANG Xiao-Hu1,2, JIA Le-Dong1,2, WANG Shu-Xian1,2, ZHAO Hui-Yan1,2, XU Xin-Fu1,2, LU Kun1,2, LI Jia-Na1,2,*, and WANG Rui1,2,*

1College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715, China;2Academy of Agricultural Sciences, Southwest University, Chongqing 400715, China

is an optimum crop for repairing the heavy metal pollution of soil. To identify the associated SNP locus and candidate genes with arsenic (As) stress tolerance in, we measured and performed genome-wide association studies (GWAS) on relative root length (RRL), relative hypocotyl length (RHL), and relative fresh weight (RFW) of 140 rapeseed accessions by the60K Illumina Infinium SNP array. In total, 15 SNPs significantly associated with RRL, 20 loci with RHL, and 35 SNP with RFW were identified, and each of SNP explained 13.31%–24.39%, 18.04%–33.82%, and 20.19%–25.06% of observed phenotypic variation, respectively. The most notable significant SNPs were located on chromosomes A02, A07, and C02, which were repeatedly detected and associated with RRL, RHL, and RFW simultaneously. Based on the rapeseed genome annotation of the linkage disequilibrium (LD) regions, we predicted 61 As resistance of candidate genes, among them,,,,,, and, were related to the heavy metal absorbing and transporting. With the results of qRT-PCR, theandwere obviously induced by As stress treatment in roots, hypocotyls and leaves, indicating that they were the important candidate genes related to As absorption and transport in. These results provide a reference for elucidating the regulation mechanism of candidate genes and improving agronomic traits inunder As stress.

L.; As stress resistance; genome-wide association studies (GWAS); candidate genes

2018-07-05;

2018-10-08;

2018-11-06.

10.3724/SP.J.1006.2019.84093

王瑞, E-mail: ruiwang71@163.com; 李加納, E-mail: ljn1950@swu.edu.cn, Tel: 023-68250642

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

曲存民, E-mail: drqucunmin@swu.edu.cn; 馬國(guó)強(qiáng), E-mail: mgq12358@163.com

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFD0100505), 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401412, 31571701), 重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(cstc2015jcyjBX0001, cstc2016shms-ztzx80010, cstc2017jcyjAX0321), 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-12), 111人才引智基地建設(shè)項(xiàng)目(B12006)和中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金(XDJK2016A005, XDJK2016B030)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Plan (2018YFD0100505), the National Natural Science Foundation of China (31401412, 31571701), Chongqing Basic Scientific and Advanced Technology Research (cstc2015jcyjBX0001, cstc2016shms- ztzx80010,cstc2017jcyjAX0321), the China Agriculture Research System (CARS-12), the 111 Project (B12006), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2016A005, XDJK2016B030).

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20181105.1326.018.html