雷雪平，耿 毅，鄧龍君，甘維熊，黃小麗，陳德芳，歐陽(yáng)萍

( 1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130； 2.雅礱江水電開(kāi)發(fā)有限公司，四川 西昌 615000 )

溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)廣泛分布于自然界，是一種常見(jiàn)的人—獸—魚共患條件致病菌[1-2]，可致人類急性胃腸道感染[3]、創(chuàng)傷感染[4]和腦膜炎[5]等；也可感染尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[6]、鰱魚(Hypophthalmichthysmolitrix)[7]、黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[8]等多種淡水魚類，引起腹水病[9]、皮膚潰瘍[10-11]和出血性敗血癥[12]等；同時(shí)也對(duì)中華鱉(Trionyxsinensis)[13]、牛蛙(Ranacatesbiana)[14]、大鯢(Andriasdavidianus)[15]等兩棲類和爬行類水生動(dòng)物致病，給人類與水產(chǎn)養(yǎng)殖都造成較大的威脅。

長(zhǎng)絲裂腹魚(Schizothoraxdolichonema)，是長(zhǎng)江上游的特有魚類。近年來(lái)，由于梯級(jí)水電站的建立，破壞了河流的連續(xù)性，阻礙了魚類的分布與洄游，加之人類大量的捕撈，導(dǎo)致長(zhǎng)絲裂腹魚資源量急劇下降，已被《中國(guó)物種紅色名錄》記錄為瀕危物種。2017年4月，西昌某養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖的長(zhǎng)絲裂腹魚暴發(fā)一種以出血和角膜發(fā)白為主要特征的疾病，導(dǎo)致長(zhǎng)絲裂腹魚的死亡率達(dá)20%。為探究此次發(fā)病之病因，自發(fā)病魚體內(nèi)分離純化病原菌，獲得病原菌優(yōu)勢(shì)菌株LXP170412。通過(guò)表型特征測(cè)定、16S rDNA與gyrB基因序列分析鑒定，菌株LXP170412為溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)。進(jìn)一步進(jìn)行病原菌的藥敏試驗(yàn)，以期為有效防治該病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

患病長(zhǎng)絲裂腹魚采自西昌某養(yǎng)殖場(chǎng)，具有明顯臨床癥狀，體質(zhì)量352.5～674.7 g；健康長(zhǎng)絲裂腹魚購(gòu)于四川攀西某養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量(246.2±15.3) g。腦心浸液瓊脂(北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)；MH培養(yǎng)基(杭州微生物試劑有限公司)；細(xì)菌DNA提取試劑盒、Mix、DNA分子Marker[天根生化科技(北京)有限公司]；藥敏紙片(杭州天和微生物試劑有限公司)；細(xì)菌生化微量鑒定管(杭州微生物試劑有限司)。

1.2 病原菌的分離純化

無(wú)菌條件下，自病魚肝、脾、腎取樣，劃線接種于腦心浸液瓊脂平板，28 ℃培養(yǎng)24～48 h，挑取形態(tài)、大小一致的單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落，于腦心浸液瓊脂平板上再次劃線，獲得純培養(yǎng)菌株，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 人工感染試驗(yàn)

將獲得的優(yōu)勢(shì)培養(yǎng)菌株LXP170412接種到腦心浸液瓊脂平板，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，用無(wú)菌生理鹽水洗下，用麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整細(xì)菌密度分別為2.0×108、2.0×107、2.0×106、2.0×105cfu/mL。健康長(zhǎng)絲裂腹魚暫養(yǎng)7 d后，腹腔注射0.5 mL不同密度的菌液進(jìn)行人工感染，對(duì)照組魚注射等量無(wú)菌生理鹽水，試驗(yàn)期14 d。攻毒后每日觀察試驗(yàn)魚的癥狀和發(fā)病死亡情況，對(duì)死亡魚及時(shí)進(jìn)行剖檢和致病菌的再次分離。

1.4 病原菌菌株表型特性測(cè)定

觀察分離菌的菌落形態(tài)，革蘭氏染色觀察細(xì)菌形態(tài)。挑取單個(gè)菌落接種于微量生化反應(yīng)管，28 ℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)生化鑒定管的說(shuō)明書判定結(jié)果，并根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[16]對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定。

1.5 病原菌16S rDNA與gyrB基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

使用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取新鮮細(xì)菌基因組DNA。采用一對(duì)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因的通用引物[17](上游引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′)和gyrB基因通用引物[18][上游引物：5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA(TC)GC(TCAG)GG(TCAG)GG(TCAG)AA(AG)TT(TC)GA-3′；下游引物：5′-AGCAGGGTACGGA TGTGCGAGCC(AG)TC(TCAG)AC(AG)TC(TCAG)GC(AG)TC(TCAG)GTCAT-3′]分別擴(kuò)增16S rDNA基因與gyrB基因，預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別約為1500 bp與1200 bp。其反應(yīng)體系與條件參照文獻(xiàn)[19]。反應(yīng)結(jié)束后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小并回收純化。純化后產(chǎn)物送成都擎科有限公司測(cè)序。將分離菌株的16S rDNA基因序列和gyrB基因序列GenBank中已知核酸序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，分別調(diào)出與其同源性較高的序列進(jìn)行多序列比對(duì)，用Mega 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 病原菌藥物敏感性檢測(cè)

采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感性檢測(cè)，將分離菌株接種于腦心浸液液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng) 24 h，麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌液密度為2.0×108cfu/mL，將菌液均勻涂布于MH平板上，貼上藥敏紙片，28 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈大小，并參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)(M100-S18)判定菌株對(duì)藥物的敏感性。

2 結(jié) 果

2.1 臨床癥狀及剖解檢查

患病裂腹魚主要表現(xiàn)為食欲減退甚至絕食，體色變淡，眼角膜混濁(圖1a)，體表、鰭條基部、下頜及鰓蓋等出血(圖1a、b)。解剖病魚發(fā)現(xiàn)，肝腫大、淤血，邊緣鈍圓，呈紫紅色；脾腫大，呈暗紅色(圖1c)；腎腫大、出血(圖1d)；鰾壁明顯充血、出血；部分病魚膽囊腫大、脂肪充血、出血，腹腔內(nèi)少量腹水。

圖1 長(zhǎng)絲裂腹魚感染溫和氣單胞菌的體征a.下頜出血，眼角膜混濁(箭頭)； b.體表出血(箭頭)； c.脾臟腫大(箭頭)，鰾壁充血、出血； d.膽囊腫大，腎腫大，出血(箭頭).

2.2 病原菌的分離與形態(tài)特性觀察

自病魚的肝、脾和腎組織中分離獲得一株優(yōu)勢(shì)菌LXP170412。28 ℃培養(yǎng)24 h，分離菌株在腦心浸液瓊脂平板上生長(zhǎng)良好，形成圓形、表面光滑、半透明狀、邊緣整齊、略凸起、無(wú)水溶性色素的菌落(圖2a)。經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，菌體呈革蘭氏陰性短桿狀，兩端鈍圓，多數(shù)單個(gè)排列，無(wú)莢膜，無(wú)芽孢(圖2b)。

圖2 菌株LXP170412菌落形態(tài)(a)及革蘭氏染色(b)

2.3 人工感染試驗(yàn)

注射菌液，2.0×108、2.0×107、2.0×106、2.0×105cfu/mL密度組在注射感染第2 d出現(xiàn)反應(yīng)遲緩、游動(dòng)異常、體表鰭基出血，并開(kāi)始出現(xiàn)死亡，至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各密度組死亡率分別為90%、60%、20%與10%，發(fā)病死亡魚主要表現(xiàn)為體表與內(nèi)臟器官的充血與出血，與自然發(fā)病魚的臨床特征相似，而對(duì)照組則在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)無(wú)任何異常。由人工感染發(fā)病死亡的長(zhǎng)絲裂腹魚體內(nèi)再次分離細(xì)菌，獲得與感染接種菌形態(tài)、理化特性與16S rDNA基因序列一致的菌株。采用寇氏法計(jì)算，分離菌對(duì)長(zhǎng)絲裂腹魚的半致死密度為1.002×107cfu/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明，該分離株是此次患病長(zhǎng)絲裂腹魚的病原菌。

表1 菌株LXP170412人工感染試驗(yàn)結(jié)果

2.4 病原菌的理化特性

分離菌株LXP170412的主要生理生化特性見(jiàn)表2，它與溫和氣單胞菌生理生化特性基本一致，初步判定為溫和氣單胞菌。

2.5 病原菌16S rRNA與gyrB 基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用擴(kuò)增16S rRNA基因和gyrB基因的通用引物，擴(kuò)增出分離株的16S rRNA基因和gyrB基因，分別得到預(yù)期大小的條帶。純化測(cè)序后分別得到長(zhǎng)度為1410 bp和1107 bp的片段，GenBank基因登陸號(hào)分別為MG356656與MG356657，在GenBank中與已知核酸序列進(jìn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)分離菌與溫和氣單胞菌的同源性最高，分別高達(dá)100%和98%。在基于分離菌的16S rRNA和gyrB序列與GenBank中同源性較高的氣單胞菌屬細(xì)菌16S rRNA及gyrB基因序列建立的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上，該分離菌株與溫和氣單胞菌聚為一族(圖2、圖3)。結(jié)合生理生化特性分析，確定菌株LXR170412為溫和氣單胞菌。

2.6 藥物敏感性檢測(cè)

溫和氣單胞菌LXP170412對(duì)18種抗生素的敏感性見(jiàn)表3。由表3可知，溫和氣單胞菌LXP170412僅對(duì)諾氟沙星、氧氟沙星、強(qiáng)力霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、頭孢噻肟6種藥物敏感，對(duì)氟苯尼考、紅霉素中度敏感，對(duì)新霉素、恩諾沙星、慶大霉素、羅紅霉素、復(fù)方新諾明、四環(huán)素、丁胺卡那、青霉素、阿莫西林、頭孢拉定10種藥物耐藥。

表2 分離株LXP170412的生理生化特性

注：“+”為陽(yáng)性，“-”為陰性，“”為產(chǎn)酸產(chǎn)氣，“d”為種間不同反應(yīng).

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的分離菌株LXP170412與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖3 基于gyrB基因序列構(gòu)建的分離菌株LXP170412與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

藥物藥物含量μg/片抑菌圈直徑mm敏感性藥物藥物含量μg/片抑菌圈直徑mm敏感性新霉素3012R四環(huán)素3010R恩諾沙星1024R環(huán)丙沙星522S諾氟沙星1023S紅霉素1517I慶大霉素1012R丁胺卡那3013R氧氟沙星528S青霉素106R羅紅霉素1512R阿莫西林106R氟苯尼考3017I頭孢拉定3010R強(qiáng)力霉素3016S頭孢噻肟3041S左氧氟沙星524S復(fù)方新諾明23.756R

注：“R”為耐藥，“S”為敏感，“I”為中度敏感.

3 討 論

溫和氣單胞菌廣泛存在于水環(huán)境中，可引起魚類及其他水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物多種疾病，是一種重要的條件致病菌[10]。據(jù)報(bào)道，該菌可以感染黃顙魚[20]、大麻哈魚(Oncorhynchusketa)[21]、河鱸(Percafluviatilis)[22]、西伯利亞鱘(Acipenserbaerii)[2]等多種養(yǎng)殖魚類，并引起大量死亡，也能引起牛蛙潰瘍癥[14]和鱉敗血癥[23]。本研究自臨床癥狀表現(xiàn)為體表出血與眼角膜渾濁的自然發(fā)病長(zhǎng)絲裂腹魚體內(nèi)分離到一株革蘭氏陰性桿菌，并通過(guò)其表型和分子生物學(xué)特性鑒定其即為溫和氣單胞菌，人工感染證實(shí)，溫和氣單胞菌自然情況下也可感染并致死長(zhǎng)絲裂腹魚。在長(zhǎng)絲裂腹魚的養(yǎng)殖中應(yīng)重視溫和氣單胞菌所造成的危害。

近年來(lái)，就溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、嗜水氣單胞菌等條件性致病菌對(duì)水生動(dòng)物具有強(qiáng)致病性不斷見(jiàn)諸報(bào)道[24-29]，條件性致病菌感染已成為威脅我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖的重要疾病之一。對(duì)于這些條件致病菌感染的發(fā)生機(jī)制，尤其是水質(zhì)環(huán)境因素在其感染與致病中的作用尚不完全清楚，在本次取樣時(shí)發(fā)現(xiàn)，發(fā)病場(chǎng)池塘的底質(zhì)較厚，水體有機(jī)質(zhì)含量較高，這是否與本次溫和氣單胞菌感染致病有關(guān)值得進(jìn)一步研究，以便為更好的防控這些條件性致病菌的危害提供依據(jù)。長(zhǎng)絲裂腹魚自然感染溫和氣單胞菌后，臨床癥狀主要表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、食欲減退，體表褪色，肌肉與鰭條充血、出血；內(nèi)臟器官淤血、出血，呈明顯的敗血癥狀。與羅非魚[30]和金魚(Carassiusauratus)[31]感染溫和氣單胞菌的癥狀相似，但也與嗜水氣單胞菌[32]與遲緩愛(ài)德華氏菌(Edwardsiellatarda)[33]等感染的臨床表現(xiàn)較為相似，給臨床診斷帶來(lái)困難。因此，提高魚類疾病診斷的準(zhǔn)確性應(yīng)強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)室診斷的作用。

溫和氣單胞菌LXP170412雖然對(duì)諾氟沙星、氧氟沙星、強(qiáng)力霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星等藥物敏感，但我國(guó)相關(guān)法規(guī)已明令禁止諾氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星與環(huán)丙沙星等喹諾酮類藥物在食用動(dòng)物養(yǎng)殖中的使用；同時(shí)該菌對(duì)動(dòng)物專用的恩諾沙星、氟苯尼考等耐藥或中度敏感。在本次病例中養(yǎng)殖者曾用恩諾沙星進(jìn)行內(nèi)服治療，結(jié)果無(wú)效，改用強(qiáng)力霉素才有效控制了疫情。由此可見(jiàn)，臨床用藥應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇用藥，以提高用藥的有效性，避免藥物濫用。另外，溫和氣單胞菌是一種廣泛分布于水環(huán)境中的條件致病菌，其感染往往與水溫、水質(zhì)、養(yǎng)殖密度、應(yīng)激等有關(guān)[34]，因此，在養(yǎng)殖環(huán)境控制與飼養(yǎng)管理上也應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的改善工作以降低該病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。