梁會娟 梁海乾 魏向陽 周 欣 張 賽

膠質(zhì)瘤屬于神經(jīng)系統(tǒng)的一種惡性腫瘤，其發(fā)病率最高，據(jù)相關(guān)調(diào)查報(bào)道顯示：顱內(nèi)惡性腫瘤的發(fā)病率為每年每10萬人中有6.8人，而其中膠質(zhì)瘤就占到80%[1]。目前普遍采用手術(shù)切除并輔以術(shù)后放、化療治療膠質(zhì)瘤，化療在諸多治療環(huán)節(jié)中至關(guān)重要，其成敗對病人的生活質(zhì)量和預(yù)后影響很大。隨著應(yīng)用時(shí)間的延長，替莫唑胺、紫杉醇，療效下降與耐藥趨勢越來越明顯，且耐藥均與P53相關(guān)，兩者聯(lián)合，能否起到起到協(xié)同作用?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87（武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦研所），PTX、TMZ（由美國Sigma公司提供），胎牛血清（由美國Hyclone公司提供），DMEM培養(yǎng)基（由美國Gibco公司）提供，CCK-8試劑盒（由武漢博士德公司提供）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞置入10%胎牛血清HDMEM中進(jìn)行培養(yǎng)，放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)，5%CO2，并用0.25%胰蛋白酶消化傳代，每3天1次。

1.3 TMZ、PTX半數(shù)抑菌濃度（IC50）確定 ①對數(shù)生長期U87細(xì)胞，按1×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板，24 h。②加入濃度PTX（0.5、0．03125 ng/mL）或TMZ（5、0.3125 μg/mL）或兩者混合液干預(yù)細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，加入每孔CCK-8溶液（5 mg/mL）10μL，終體積100 μL，孵育1 h，采用全自動酶標(biāo)儀，波長450nm下測定光密度（OD）值，生長抑制率（%）=（OD對照－OD藥物）/（OD對照－OD空白）×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用（）表示，采用配對t檢驗(yàn)比較（雙側(cè)），P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 PTX、TMZ、PTX+TMZ細(xì)胞生長抑制率的比較[1]PTX、TMZ的IC50分別為0.5 ng /mL和5 μg/mL，PTX+TMZ與TMZ、PTX單獨(dú)作用于U87的結(jié)果比較：0.03125 ng/mL PTX與0.3125 ng/mL TMZ兩個(gè)濃度聯(lián)合，在24 h與48 h呈現(xiàn)拮抗作用，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）；72 h兩者聯(lián)合呈現(xiàn)協(xié)同作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.01）；5 ng/mL PTX與0.5 ug/mL TMZ兩個(gè)濃度聯(lián)合，與二者單獨(dú)作用比較，24 h、48 h內(nèi)呈拮抗作用（P均＜0.01）。作用72 h與兩者單獨(dú)作用比較，差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 PTX、TMZ、PTX+TMZ細(xì)胞生長抑制率

2.2 光鏡下的聯(lián)合作用圖片[2]72 h后，鏡下可見大量的巨核細(xì)胞，紡錘體形成，細(xì)胞周期阻滯于M期，有絲分裂停止。見圖1b。

注：圖1a：200倍光鏡下U87細(xì)胞干預(yù)前圖片；圖1b干預(yù)后（0．03125+0．3125 PTX+TMZ聯(lián)合作用72 h后）的圖片。

3 討 論

膠質(zhì)瘤屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種比較常見的惡性腫瘤，在侵襲過程中猶如樹根一樣生長和擴(kuò)張。盡管現(xiàn)階段對于膠質(zhì)瘤治療可采用免疫學(xué)方法先進(jìn)性標(biāo)記，然后使用免疫顯微鏡將病變組織盡可能地切除，但是由于患者的顱內(nèi)解剖以及功能定位的復(fù)雜性，使得完全切除存在非常大的困難，患者在手術(shù)后實(shí)施放化療輔助治療也仍然無法完全遏止惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)展，預(yù)后往往不樂觀。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)調(diào)查顯示，膠質(zhì)瘤Ⅲ級患者的生存期通常只有2～3年，而Ⅳ級患者生存期僅僅只有1年左右，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者[3]。

從表1我們看到，48 h內(nèi)呈現(xiàn)拮抗作用，72 h后表現(xiàn)為協(xié)同作用，且在1/6治療劑量下，兩者協(xié)同作用發(fā)揮到了最大。光鏡下（圖1）見兩者聯(lián)合作用有絲分裂相停滯于M期，大量紡錘體形成，細(xì)胞呈巨核細(xì)胞表現(xiàn)。分析紫杉醇是一種水溶性分子，作用于微管網(wǎng)，與N端31位和217-231位氨基酸結(jié)合，誘導(dǎo)和穩(wěn)定微管蛋白，細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。盡管無法對DNA直接起作用，但是其可以對Raf-1的級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生誘導(dǎo)，并進(jìn)一步誘導(dǎo)P53表達(dá)，導(dǎo)致Raf-1/Bcl-2磷酸化，抑制Bcl-2，從而引起了P53表達(dá)的上調(diào)。研究表明，紫杉醇耐藥性與P53的表達(dá)相關(guān)，Li G等[4]研究中利用P53突變或者沉默構(gòu)建小鼠模型，通過實(shí)驗(yàn)顯示，8 mg/kg的紫杉醇和劑量為2Gy的放療在移植了非小細(xì)胞肺癌的小鼠模型中具有明顯的抑制作用[5]。替莫唑胺屬于烷化劑，在人體當(dāng)中通過非酶解途徑可以促進(jìn)DNA的甲基化作用，甲基化產(chǎn)物包括了N3、N7位的甲基化與O6-甲基鳥嘌呤（O6-mG）的甲基化。國外有研究報(bào)道了分別使用不同劑量替莫唑胺（25 ummol/L和50 ummol/L）作用于MGMT甲基化與O6-甲基鳥嘌呤DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）的剔除模型，結(jié)果顯示替莫唑胺耐藥性和MGMT具有顯著的劑量相關(guān)性，同時(shí)和P53的表達(dá)相關(guān)。兩者共同對P53產(chǎn)生作用，對核糖核苷酸還原酶基因的表達(dá)具有上調(diào)作用，同時(shí)保證DNA的穩(wěn)定[6]。Gori JL等[7]人以基因修飾后高表達(dá)MGMT的狗模型為實(shí)驗(yàn)對象，對其采用替莫唑胺和卡氮芥治療，當(dāng)兩者的活性分別為550～850 mg/m2和150 mg/m2時(shí)與離體時(shí)劑量的5倍相當(dāng)。國內(nèi)學(xué)者丁照義及其導(dǎo)師帶領(lǐng)的課題組，以膠質(zhì)瘤大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，開展了體外培養(yǎng)大鼠膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，通過研究結(jié)果顯示，給予大鼠紫杉醇、替莫唑胺后，大鼠的膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長收到明顯的抑制，并且細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，并且通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，二者聯(lián)用的效果比單獨(dú)用藥效果更為理想，由此指出，這種作用效果是與Caspse-3 mRNA表達(dá)上調(diào)有關(guān)[6]。

總之，紫杉醇與替莫唑胺聯(lián)合，可以發(fā)揮明顯的協(xié)同作用，隨著作用時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)系統(tǒng)功能耗竭，損傷瀑布啟動，酸中毒、缺氧、營養(yǎng)不良的微環(huán)境逐步惡化，遺傳物質(zhì)、新陳代謝及能量轉(zhuǎn)化等都發(fā)生了抑制崩潰，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。