喬金平 戴夢(mèng)緣 吳丹丹 彭麗朵 費(fèi)廣鶴 徐元宏

呼吸道病毒感染潛伏期短、起病急、多種病毒可引起類(lèi)似的癥狀，致死率高[1]。呼吸道病毒種類(lèi)繁多，給檢測(cè)和診斷帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。核酸檢測(cè)的靈敏度和特異性均高于其他方法，因而已被廣泛用于臨床檢測(cè)[2～3]。

核酸檢測(cè)最常用的實(shí)時(shí)熒光定量PCR （qPCR）分單重和多重，單重qPCR一次只能檢測(cè)一種病原體，多重qPCR受PCR儀器限制，一般1管同時(shí)檢測(cè)不超過(guò)3種病原體（3待測(cè)加1內(nèi)對(duì)照）。而呼吸道感染常見(jiàn)的有十幾種病毒，且常有多種病毒的混合感染。所以一份標(biāo)本要分十幾次單重qPCR或4～6次多重qPCR才能涵蓋常見(jiàn)呼吸道病毒，通量低且操作繁瑣[4～5]。Luminex 18種呼吸道病毒多重檢測(cè)試劑盒（RVP）可在4 h內(nèi)1管同時(shí)檢測(cè)18種常見(jiàn)呼吸道病毒[3]。單重qPCR相對(duì)多重檢測(cè)的RVP來(lái)說(shuō)，其靈敏度和特異性都更高，因此，本研究通過(guò)與單重qPCR比對(duì)，簡(jiǎn)單評(píng)估RVP對(duì)呼吸道病毒的檢測(cè)性能。RVP檢測(cè)有PCR產(chǎn)物雜交步驟，需開(kāi)蓋取PCR產(chǎn)物進(jìn)行雜交，很容易造成下一批次檢測(cè)時(shí)的污染。本研究以PCR產(chǎn)物污染的實(shí)例，探討如何排查污染源并制定防止污染的策略，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 100例取自本醫(yī)院呼吸科的咽拭子標(biāo)本。清晨進(jìn)食前，使用醫(yī)用無(wú)菌生理鹽水漱口數(shù)次，用病毒采樣管配套長(zhǎng)棉簽擦拭兩側(cè)腭弓和咽、扁桃體上的分泌物。立即送檢或于4 ℃保存并2 h內(nèi)送檢。如不能及時(shí)檢測(cè)，需于-80 ℃保存。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 QIAamp MinElute Virus Spin購(gòu)自德國(guó)Qiagen；單重qPCR試劑盒[季節(jié)性H3亞型流感病毒（Influenza A H3）、A型呼吸道合胞病毒（RSV）、甲型H1N1流感病毒（Influenza A H1N1）]均購(gòu)自北京金豪；18種呼吸道病毒多重檢測(cè)試劑盒（RVP）購(gòu)于美國(guó)Luminex公司；病毒采樣管和配套長(zhǎng)棉簽購(gòu)于北京友康恒業(yè)公司。

1.2.2 儀器 PCR儀（博日）；高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf）；Luminex 200流式點(diǎn)陣儀（美國(guó)Luminex）；Cobas Z480熒光定量PCR儀（瑞士Roche）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 核酸提取 取200 μL渦旋后的咽拭子標(biāo)本，加入MS2 [RVP內(nèi)對(duì)照（Internal control）]，依照說(shuō)明書(shū)，使用QIAamp MinElute Virus Spin試劑盒提取核酸（DNA和RNA），核酸置于-80℃保存。

2.2 qPCR 依據(jù)上述三種單重qPCR說(shuō)明書(shū)，使用2.1中的核酸進(jìn)行qPCR檢測(cè)。

2.3 RVP檢測(cè) 按照RVP說(shuō)明書(shū)操作：①核酸提?。和?.1。②RVP多重PCR擴(kuò)增：陽(yáng)性對(duì)照（RVP中Run Control）為λ噬菌體，陰性對(duì)照為不含MS2的DEPC水。③PCR產(chǎn)物雜交：取PCR產(chǎn)物和 Bead Mix及SAPE工作液雜交。④上機(jī)讀數(shù)：Luminex 200讀數(shù)，TDAS分析結(jié)果。

2.4 Luminex平臺(tái)PCR產(chǎn)物雜交污染問(wèn)題的處理 設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，逐一將RVP試劑盒中PCR擴(kuò)增組份及環(huán)境、耗材等進(jìn)行排除，并針對(duì)可能存在污染的環(huán)節(jié)，將注意事項(xiàng)加到SOP中，防止污染的再次發(fā)生。

3 結(jié) 果

3.1 qPCR及RVP檢測(cè)結(jié)果 隨機(jī)選20例標(biāo)本，提取的同一份核酸用qPCR和RVP同時(shí)檢測(cè)，驗(yàn)證RVP的性能。見(jiàn)表1，RVP與qPCR對(duì)4、6和8三種病毒的檢測(cè)結(jié)果一致。后續(xù)使用RVP又檢測(cè)了80例，連同上述20例，共100例標(biāo)本。其中陽(yáng)性41例，有10例為混合感染（2、3、4種混合分別為6、2、2例）。

表1 20例咽拭子的qPCR和RVP結(jié)果以及二者一致性比較

3.2 Luminex平臺(tái)PCR產(chǎn)物雜交污染問(wèn)題的處理 在本研究中，有一批次的結(jié)果TDAS分析后均為NO CALL，原因是陰性對(duì)照有個(gè)別分析物結(jié)果高于或接近陽(yáng)性閾值，如Para 3、Para 2、Influenza B，同時(shí)此三者在待測(cè)標(biāo)本中也出現(xiàn)大范圍陽(yáng)性或數(shù)值偏高。本次污染考慮是在PCR加樣時(shí)遇到污染，原因包括PCR反應(yīng)組份污染、耗材污染、實(shí)驗(yàn)環(huán)境氣溶膠污染等。①對(duì)于耗材污染，本次污染源排查時(shí)，首先更換耗材并用純水和70%酒精清洗移液器。②對(duì)于實(shí)驗(yàn)環(huán)境，采取了開(kāi)窗通風(fēng)、紫外線照射，使用70%酒精擦拭生物安全柜內(nèi)壁。③RVP中PCR組份包括RNase-Free、RT-PCR Buffer、Primer Mix、dNTP Mix、Enzyme Mix。RVP試劑盒價(jià)格昂貴，所以需用較小的試劑消耗來(lái)排查污染源。RVP試劑盒中Primer Mix與Enzyme Mix的量最少，其他三組份都為過(guò)量，且已分裝成多管（如證明已被污染，則直接將這三種組份同時(shí)換成新試劑即可）；因此重點(diǎn)排查前兩組份，同時(shí)驗(yàn)證是否為實(shí)驗(yàn)環(huán)境污染。為此，通過(guò)正交試驗(yàn)依次進(jìn)行了如表2和表3所示的4批次5種體系（A-E）排查實(shí)驗(yàn)，體系A(chǔ)-D均重復(fù)兩次實(shí)驗(yàn)。批次1體系A(chǔ)結(jié)果顯示仍有部分如7、11、15、16、21為陽(yáng)性（表3 A1、A2），說(shuō)明污染仍存在于體系中，提示除Primer Mix外的其他組份確定有污染。批次2體系B均陰性（表3 B1、B2），而體系C仍有部分分析物偏高（表3 C1、C2）。綜合第1、2批次，提示Primer Mix未被污染。批次3體系D均陰性（表3 D1、D2），提示原生物安全柜未被污染。批次4體系E均陰性（表3中E組），提示 Enzyme Mix未被污染。排查結(jié)果顯示：原生物安全柜未污染；Primer Mix和 Enzyme Mix未污染；而其他三組份可能被污染，如前所述，對(duì)此三組份直接更換新試劑。在隨后進(jìn)行的標(biāo)本檢測(cè)中，均未發(fā)生再次污染，也進(jìn)一步驗(yàn)證了排查結(jié)果的準(zhǔn)確性。

表2 4批次排查實(shí)驗(yàn)的5種組合體系

4 討 論

本研究中，我們通過(guò)從100例標(biāo)本中隨機(jī)選取了20例進(jìn)行了qPCR的對(duì)比檢測(cè)，以評(píng)估RVP試劑盒的性能。本次實(shí)驗(yàn)僅使用了三種病毒的qPCR試劑盒，結(jié)果顯示RVP與qPCR的結(jié)果一致。RVP的檢測(cè)限要高于單個(gè)病毒的qPCR，因此在多重感染時(shí)部分病毒會(huì)出現(xiàn)假陰性的可能[5]。

本次實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)了PCR體系的污染，PCR產(chǎn)物污染問(wèn)題也是Luminex平臺(tái)在開(kāi)展基于多重PCR檢測(cè)時(shí)最容易出現(xiàn)的問(wèn)題。本研究以較小的代價(jià)排除了污染源，先后進(jìn)行了4個(gè)批次實(shí)驗(yàn)，依次更換了PCR反應(yīng)組分、操作空間這兩個(gè)對(duì)PCR反應(yīng)有很大影響的因素。結(jié)果提示是因?yàn)槌艘锖兔竿獾钠渌NPCR反應(yīng)組份被污染。經(jīng)過(guò)文獻(xiàn)和相關(guān)操作規(guī)程的總結(jié)，具體防止Luminex平臺(tái)PCR產(chǎn)物污染的注意事項(xiàng)對(duì)所有基于PCR產(chǎn)物開(kāi)蓋做雜交的實(shí)驗(yàn)方法均有一定的適用性。具體注意事項(xiàng)如下：

表3 RVP 污染排查結(jié)果(Raw signals)

4.1 嚴(yán)格分區(qū)操作 一般分4個(gè)區(qū)，試劑準(zhǔn)備區(qū)(Ⅰ），核酸提取和PCR加樣區(qū)（Ⅱ），PCR擴(kuò)增區(qū)（Ⅲ）、雜交區(qū)及Luminex上機(jī)區(qū)（Ⅳ）。Ⅰ區(qū)和Ⅱ區(qū)在空間不夠時(shí)可以合并，因此至少分3個(gè)區(qū)。另外PCR加樣、PCR產(chǎn)物開(kāi)蓋取樣雜交，均應(yīng)在所在分區(qū)的全排的生物安全柜中進(jìn)行。

4.2 廢物處理 所有含PCR產(chǎn)物的廢棄物均須使用能密封的袋子密封起來(lái)，再棄于遠(yuǎn)離PCR實(shí)驗(yàn)室的廢物桶。

4.3 操作習(xí)慣 在實(shí)驗(yàn)操作中須養(yǎng)成良好的防污染的習(xí)慣，例如不用單手開(kāi)蓋、勤換手套、加樣時(shí)移液器吸頭盒遠(yuǎn)離廢物桶、打掉吸頭時(shí)防止飛濺、用合適的吸頭吸取試劑以避免在取樣時(shí)移液器外壁碰到試劑瓶（管）的內(nèi)壁等。

4.4 耗材和實(shí)驗(yàn)環(huán)境 使用帶濾芯的吸頭，實(shí)驗(yàn)前后清洗移液器內(nèi)外壁、用70%酒精擦拭生物安全柜內(nèi)壁，生物安全柜和實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)前后需照紫外至少30分鐘，實(shí)驗(yàn)室每天至少通風(fēng)30 min以上。

4.5 試劑分裝 在無(wú)污染環(huán)境中對(duì)試劑盒中的主要組份進(jìn)行分裝，以減少出現(xiàn)污染時(shí)的損失。綜上所述，RVP快速檢測(cè)與qPCR檢測(cè)的結(jié)果一致。如實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)污染，可依據(jù)上述方法進(jìn)行排查及預(yù)防。