陳艷 黃翀 徐承云

【摘要】 目的：建立檢測(cè)常染色體顯性遺傳性多囊腎病2型（polycystic kidney disease 2，PKD2）致病基因突變的方法，檢測(cè)收集的10個(gè)ADPKD家系共15例患者的PKD2基因突變情況。方法：收集江西地區(qū)經(jīng)臨床確診的常染色體顯性遺傳性多囊腎病患者15例，采集外周靜脈血5 mL，用試劑盒提取基因組DNA，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增PKD2基因全部外顯子及相近內(nèi)含子區(qū)域，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)分離純化后直接進(jìn)行基因序列測(cè)序，根據(jù)測(cè)序圖譜進(jìn)行突變分析，明確基因突變位點(diǎn)和類型。結(jié)果：15例常染色體顯性遺傳性多囊腎病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）患者中，檢測(cè)出3個(gè)正?；蚨鄳B(tài)性位點(diǎn)，分別為1號(hào)外顯子第420位堿基G置換為A，未引起編碼氨基酸改變;1號(hào)外顯子第568位堿基G置換為A，致使190位編碼氨基酸由丙氨酸改變?yōu)樘K氨酸;內(nèi)含子靠近c(diǎn)DNA第844位堿基5端的第22個(gè)堿基A置換為G。結(jié)論：可通過直接基因序列測(cè)定對(duì)PKD2進(jìn)行基因突變檢測(cè)，本研究所檢測(cè)到的3個(gè)正常基因多態(tài)性位點(diǎn)均已有報(bào)道，為開展ADPKD直接基因診斷、產(chǎn)前診斷及癥狀前診斷提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】 常染色體顯性遺傳性多囊腎病; PKD2; 基因突變; 多態(tài)性

Detection of PKD2 Gene Mutation in Chromosomal Dominant Polycystic Kidney Disease/CHEN Yan，HUANG Chong，XU Chengyun.//Medical Innovation of China，2019，16（26）：-150

【Abstract】 Objective：To set up a method for detecting the mutations of autosomal dominant olycystic kidney disease gene 2， detect the mutations of PKD2 in 15 patients from 10 ADPKD families.Method：Fifteen patients with autosomal dominant polycystic kidney disease diagnosed clinically in Jiangxi were collected，5 mL peripheral venous blood was collected and genomic DNA was extracted with the kit.All exons and close intron regions of PKD2 gene were amplified by polymerase chain reaction（PCR），after isolation and purification，PCR amplification products were directly sequenced，and mutation analysis was conducted according to the sequencing map to identify the mutation sites and types of genes.Result：Three polymorphisms were detected in 15 ADPKD patients.The c.568G>A in exon1 caused the translation change（Ala190Thr）.The other two （c.420G>A in exon1 and 844-22A>G in IVS3） did not cause the translation change.Conclusion：Gene mutation detection of PKD2 can be performed by direct gene sequencing，all the 3 normal gene polymorphisms detected in this study have been reported， providing an experimental basis for direct gene diagnosis， prenatal diagnosis and pre-symptom diagnosis of ADPKD.

【Key words】 Autosomal dominant polycystic kidney disease; PKD2; Gene mutation; Polymorphism

First-authors address：Second Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330006，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.26.039

常染色體顯性遺傳性多囊腎病（autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD）又稱為成人型多囊腎病，是最常見的腎臟遺傳病，發(fā)病率為1/400～1/1 000[1]，我國(guó)約有150萬例患者。ADPKD的主要病理特征為雙側(cè)腎臟出現(xiàn)無數(shù)大小不等的液性囊泡，并隨著年齡的增長(zhǎng)囊腫進(jìn)行性長(zhǎng)大。約50%的ADPKD患者在60歲時(shí)發(fā)展至終末期腎病（end stage renal disease，ESRD）[1]。ADPKD所致的透析患者約占整個(gè)透析人群的4.4%[2]。ADPKD可累及人體多個(gè)組織器官，除腎臟改變外，還可出現(xiàn)肝臟囊腫、胰腺囊腫、脾臟囊腫、高血壓、顱內(nèi)動(dòng)脈瘤、心瓣膜病、左心室肥大及結(jié)腸憩室等腎外病變。ADPKD是一種單基因遺傳性疾病，目前研究發(fā)現(xiàn)ADPKD的致病基因有3個(gè)，分別為PKD1、PKD2和PKD3。PKD1基因定位于人染色體16p13.3，PKD2是一個(gè)單拷貝基因，定位于人染色體4q22-23，有15個(gè)外顯子;PKD3基因僅數(shù)個(gè)家系中出現(xiàn)，目前報(bào)道較少，尚未定位克隆。PKD1基因突變引起的ADPKD患者占85%，約15%的ADPKD患者為PKD2突變所致[3]。ADPKD具有遺傳顯性延遲性，患者在發(fā)病前可能已經(jīng)將致病的基因突變遺傳給了下一代，且目前尚無特效治療方法。因此對(duì)ADPKD家系中存在發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的成員早期進(jìn)行癥狀前基因診斷，對(duì)有高發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)胎兒或胚胎進(jìn)行產(chǎn)前診斷及植入前基因診斷顯得很有意義。目前已報(bào)道的PKD2基因突變散布于PKD2基因的各個(gè)區(qū)域，無突變熱點(diǎn)，且大多數(shù)基因突變?yōu)閱伟l(fā);以上報(bào)道大多集中在高加索人種。為進(jìn)一步了解我國(guó)PKD2基因突變的發(fā)生情況，研究其突變規(guī)律，本研究通過直接序列測(cè)定（direct sequencing，DS），對(duì)江西地區(qū)收集的10個(gè)ADPKD家系共15例患者進(jìn)行PKD2全基因編碼區(qū)突變檢測(cè)，為開展ADPKD直接基因診斷、產(chǎn)前診斷及癥狀前診斷提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集江西地區(qū)10個(gè)ADPKD家系共15例經(jīng)臨床確診的ADPKD患者，納入研究，編號(hào)p1-p15，完成多囊腎病例調(diào)查表，詢問家族史并繪制家系圖。診斷標(biāo)準(zhǔn)：有陽性家族史，15～39歲，雙側(cè)腎臟囊腫數(shù)≥3個(gè);40～59歲，每側(cè)腎臟囊腫數(shù)≥2個(gè);年齡≥60歲，每側(cè)腎臟囊腫數(shù)≥4個(gè);排除標(biāo)準(zhǔn)：40歲以上，如果雙側(cè)腎臟囊腫數(shù)<2個(gè)，即可排除[1]?；颊呔橥?，且該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法 所有納入研究的對(duì)象均收集外周靜脈血5 mL，EDTA抗凝，分選白細(xì)胞，提取基因組DNA[QuickGene DNA whole blood kit S（DB-S）];通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）特異擴(kuò)增PKD2基因全部外顯子及相近內(nèi)含子區(qū)域，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)分離純化后直接進(jìn)行基因序列測(cè)序;運(yùn)用Chromas軟件查看測(cè)序結(jié)果及DNAMAN軟件進(jìn)行多重序列結(jié)果比對(duì)。

通過美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）獲得PKD2基因組序列，Genebank序號(hào)為NG_008604.1，使用Primer primier5.0軟件設(shè)計(jì)PKD2基因15個(gè)外顯子特異的PCR擴(kuò)增引物，其中Exon 1長(zhǎng)585 bp，由于其GC含量高，需進(jìn)行分段擴(kuò)增，故相互交錯(cuò)設(shè)計(jì)3對(duì)引物，覆蓋整個(gè)外顯子。通過進(jìn)行PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索出最佳的PCR反應(yīng)條件，見表1。

2 結(jié)果

在15例ADPKD患者中，檢測(cè)出3個(gè)PKD2正?；蚨鄳B(tài)性位點(diǎn)，見表2。7例患者PKD2基因的1外顯子測(cè)序顯示cDNA第420位堿基G置換為A（圖1），未編碼氨基酸改變;其中4例以雜合狀態(tài)發(fā)生，3例以純合狀態(tài)發(fā)生。10例患者PKD2基因的1外顯子測(cè)序顯示cDNA第568位堿基G置換為A（圖2），致使190位編碼氨基酸由丙氨酸改變?yōu)樘K氨酸，其中6例以雜合狀態(tài)發(fā)生，4例以純合狀態(tài)發(fā)生。2例患者內(nèi)含子區(qū)域靠近c(diǎn)DNA第844位堿基5端的第22個(gè)堿基A置換為G（圖3），不影響編碼區(qū)的特異性剪切;均以雜合狀態(tài)發(fā)生。以上3個(gè)正?；蚨鄳B(tài)性位點(diǎn)均已被報(bào)道。

3 討論

ADPKD是一種單基因遺傳性疾病，具有遺傳異質(zhì)性（genetic heterogeneity）。目前研究發(fā)現(xiàn)ADPKD的致病基因有3個(gè)，分別為PKD1、PKD2和PKD3。PKD1基因突變引起的ADPKD患者占85%，約15%的ADPKD患者為PKD2突變所致。PKD1及PKD2均已成功定位和克隆[4];PKD3基因僅數(shù)個(gè)家系中出現(xiàn)，目前報(bào)道較少，尚未定位克隆。目前PKD1及PKD2均已成功定位和克隆[4];PKD3基因目前報(bào)道較少，尚未定位克隆。

PKD1基因定位于人染色體16p13.3，有46個(gè)外顯子，基因序列長(zhǎng)約52 kb，轉(zhuǎn)錄的mRNA長(zhǎng)14.1 kb，編碼含有4 302個(gè)氨基酸的多囊蛋白-1（polycystin-1，PC-1）。PKD1基因5端的第1-33外顯子含重復(fù)序列，屬于多拷貝區(qū)[5];第34～46外顯子為單拷貝區(qū)。PKD1基因序列中GC含量較高，且人基因組內(nèi)存在6個(gè)與PKD1基因有97%～99%相似度的同源序列區(qū)，這些都顯著增加了基因檢測(cè)的難度。PC-1是一種分布于細(xì)胞膜的糖蛋白，有11個(gè)跨膜區(qū)域。PC1的氨基端位于細(xì)胞外，而羧基端位于細(xì)胞內(nèi)，約75%的蛋白結(jié)構(gòu)位于細(xì)胞外。PC1各區(qū)域的功能尚未完全研究清楚。

PKD2是一個(gè)單拷貝基因，定位于人染色體4q22-23，有15個(gè)外顯子，基因長(zhǎng)68 kb，轉(zhuǎn)錄RNA長(zhǎng)5.4 kb，編碼含968個(gè)氨基酸的多囊蛋白-2（polycystin-2，PC-2）。PC-2是一種非選擇性的鈣離子通道[6]。PC-2含有6個(gè)與PC-1跨膜區(qū)域結(jié)構(gòu)部分相似的跨膜區(qū)，其氨基端及羧基端均位于細(xì)胞內(nèi)。文獻(xiàn)[7]研究表明，PC-2的第1-223位氨基酸為氨基端的胞內(nèi)區(qū)，490-505位、572-598位及680-968位為胞內(nèi)區(qū)，224-244位、469-489位、506-526位、551-571位、599-619位及659-679位為跨膜區(qū)，245-468位、527-550位及620-658位為胞外區(qū)。其中763-796位為螺旋區(qū)-螺旋區(qū)，此區(qū)被認(rèn)為是PC-2與PC-1結(jié)合的區(qū)域，763-774位為鈣離子結(jié)合區(qū)域（EFhand）。

PC-2與PKD1編碼產(chǎn)物多囊蛋白-1（PC-1）之間相互作用，在腎小管上皮細(xì)胞的初級(jí)纖毛上形成多囊蛋白復(fù)合物，調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞的增殖和分化。纖毛致病學(xué)說認(rèn)為此多囊蛋白復(fù)合物是一種機(jī)械性刺激感受器，能感受腎小管腔內(nèi)的液壓變化，通過TRPP2通道控制Ca2+的內(nèi)流，從而影響細(xì)胞內(nèi)Ca2+和cAMP的水平。腺苷酸環(huán)化酶和酪氨酸激酶受體途徑間的異常干擾，加上細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度改變，促進(jìn)了腎小管上皮細(xì)胞的增殖和液體分泌，最終導(dǎo)致ADPKD的發(fā)生。

梅奧醫(yī)學(xué)中心是美國(guó)乃至全球研究PKD最領(lǐng)先的科研機(jī)構(gòu)，Paavola等聯(lián)合多家中心組建了PKD突變基因網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫PKDB（http：//pkdb.pkdcure.org），至今已錄入2 080個(gè)獨(dú)立家系A(chǔ)DPKD突變基因和2 323個(gè)突變位點(diǎn)[8-9]。PKDB可通過郵件接收世界范圍內(nèi)PKD突變基因測(cè)序結(jié)果，再通過審查并錄入PKD1和PKD2多態(tài)性變異以及其他PKD相關(guān)的基因變異。與國(guó)際發(fā)展趨勢(shì)相比，我國(guó)建立PKD網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫受到臨床診治水平參差不齊的制約，PKD登記和注冊(cè)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫目前尚未建立，各中心之間無協(xié)作網(wǎng)絡(luò)。由于在全國(guó)范圍內(nèi)沒有廣泛開展基因診斷，缺乏確診手段和技術(shù)，導(dǎo)致PKD確診率低，不少家系誤診漏診和不規(guī)范治療。

ADPKD基因突變的種類很多，包括有同義突變（synonymous mutation）、無義突變（nonsense mutation）、錯(cuò)義突變（missense mutation）、插入和缺失突變（deletion and insertion），移碼突變（frameshift mutation）、剪切突變（splice），內(nèi)含子沉默突變（intervening sequence silent variations，IVS silent）等。不影響編碼區(qū)特異性剪切的內(nèi)含子突變及同義突變?yōu)榛蚨鄳B(tài)性。

目前國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的PKD2基因突變報(bào)道大多集中在高加索人種，其中包含無義突變、移碼突變、剪切突變、插入或缺失突變、錯(cuò)義突變、同義突變及內(nèi)含子突變[10]。這些基因突變散布于PKD2基因的各個(gè)區(qū)域，無突變熱點(diǎn)，且大多數(shù)基因突變?yōu)閱伟l(fā)。無義突變或移碼突變可使堿基發(fā)生改變，產(chǎn)生終止密碼子，可造成基因編碼產(chǎn)物多囊蛋白的截短或缺失，使其失去正常的功能;按照Germino的標(biāo)準(zhǔn)[11]，可確定其為與致病相關(guān)的基因突變。由于缺乏對(duì)多囊蛋白的確切的功能認(rèn)識(shí)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中檢測(cè)出的錯(cuò)義或剪切突變，若基因突變位于推測(cè)的多囊蛋白重要功能區(qū)域或突變可能對(duì)編碼區(qū)的剪接造成影響，且突變僅與患者伴隨出現(xiàn)，則可高度懷疑此突變與致病相關(guān)。

ADPKD患者與普通人群一樣存在基因多態(tài)性。盡管本研究未選取健康人群為對(duì)照，但本研究檢測(cè)到的3個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)c.420G>A、c.568G>A、844-22A>G均已被報(bào)道證實(shí)為正?；蚨鄳B(tài)性位點(diǎn)[12-14]。

雖然ADPKD具體的分子生物學(xué)致病機(jī)制尚不明確[15-17]，但“二次打擊”學(xué)說（即體細(xì)胞等位基因突變學(xué)說）被廣大學(xué)者普遍接受?！岸未驌簟睂W(xué)說認(rèn)為：囊腫的形成不僅需要從生殖細(xì)胞遺傳獲得PKD1或PKD2（兩者為等位基因）其中一個(gè)的突變基因，且需要體細(xì)胞在發(fā)育過程中在后天局部因素的作用下受到二次打擊（即丟失了正常的單倍體）。第一次突變是從患病父母遺傳來的胚系突變，存在于所有的細(xì)胞中，包括腎小管上皮細(xì)胞。第一次突變是必要的，但不足以導(dǎo)致囊腫的形成。第二次打擊，是指在個(gè)體的腎小管體細(xì)胞中發(fā)生突變，使正常的PKD1或PKD2的等位基因失活或突變，才能最終導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞的異常增殖和囊腫形成[18-20]。第二次體細(xì)胞突變可以是同一致病基因的純合性突變，也可以是PKD1或PKD2不同致病基因之間的雜合性突變。每一個(gè)腎囊腫都是體細(xì)胞基因的第二次突變引發(fā)的克隆性增殖。ADPKD患者腎囊腫只發(fā)生于部分腎單位，約占全部腎單位的5%。目前尚無方法可預(yù)知第二次打擊。

隨著分子診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，基因診斷的檢出率及準(zhǔn)確率大大提高，檢測(cè)費(fèi)用也逐漸降低至可接受范圍，使得ADPKD患者基因診斷的可行性不斷升高。但由于不同地區(qū)及不同民族間ADPKD發(fā)病情況存在差異，應(yīng)積極建立適合我國(guó)人種的簡(jiǎn)便、敏感及準(zhǔn)確性高的PKD基因診斷體系。本研究在江西地區(qū)ADPKD患者中檢測(cè)到3個(gè)正?；蚨鄳B(tài)性位點(diǎn)，為開展ADPKD直接基因診斷、產(chǎn)前診斷及癥狀前診斷提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。此外還應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大受檢家系，完善PKD1基因突變檢測(cè)，優(yōu)化檢測(cè)體系，提高突變檢出率，爭(zhēng)取早日實(shí)現(xiàn)ADPKD癥狀前診斷和產(chǎn)前診斷，及早防治并發(fā)癥，提高ADPKD患者生存質(zhì)量。

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（收稿日期：2019-06-28） （本文編輯：張爽）