黃 曦，章利亞，鄭宇紅，肖仲祥

0 引言

甲磺酸伊馬替尼(Imatinib mesylate)為苯氨嘧啶的衍生物，屬新型酪氨酸蛋白激酶抑制劑。伊馬替尼對(duì)酪氨酸激酶中的BCR-ABL抑制作用較為突出，IC50值可達(dá)207 nmol/L[1]。甲磺酸伊馬替尼是最早用于治療慢性髓性白血病(CML)的藥物，目前其不僅是治療慢性期、急變期或加速期CML和復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性胃腸間質(zhì)瘤(GIST)的一線用藥，還可以用于治療費(fèi)城(Ph)染色體陽性的急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、c-Kit 突變或擴(kuò)增的晚期黑色素瘤、慢性嗜酸性粒細(xì)胞白血病(CEL)、高嗜酸性粒細(xì)胞綜合征(HES)、伴巨大淋巴結(jié)腫的竇性組織增生癥、晚期隆突性皮膚纖維肉瘤等[2]。伊馬替尼口服生物利用度高，可達(dá)98%，主要經(jīng)肝微粒體細(xì)胞色素P450中的CYP3A4代謝，循環(huán)中主要的活性代謝物N-去甲基哌嗪衍生物顯示出比母體藥物伊馬替尼更高的活性。

目前已有文獻(xiàn)報(bào)道大鼠血漿伊馬替尼的測(cè)定方法，但鮮有同時(shí)測(cè)定伊馬替尼及其代謝物的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究擬建立一種快速、靈敏、專屬性強(qiáng)的UPLC-MS/MS 法同時(shí)檢測(cè)伊馬替尼及其代謝物血藥濃度，為研究伊馬替尼與其他藥物的相互作用和臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 試劑 甲磺酸伊馬替尼(美國Sellect Chemicals LLC，批號(hào)：S102606，純度：>99%)，N-去甲基伊馬替尼對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：A8029，純度：>99%)，卡馬西平對(duì)照品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：0142-9503，純度：>99%)，HPLC色譜級(jí)乙腈，甲醇，甲酸。

1.2 儀器 超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司)；高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；Milli-Q A10超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)；渦旋混合器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；電子分析天平(上海方瑞儀器有限公司)。

1.3 主要試劑的配制 精密稱取甲磺酸伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)品和N-去甲基伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)品5 mg 于50 ml的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度線，混勻，各得濃度為 100 μg/ml的甲磺酸伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)品和N-去甲基伊馬替尼標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。精密稱取卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品1 mg置于10 ml的容量瓶中，用甲醇溶解定容至10 ml，混勻，得到濃度為100 μg/ml的卡馬西平標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用微量移液槍準(zhǔn)確移取100 μg/ml卡馬西平儲(chǔ)備液1.0 ml于100 ml容量瓶中，甲醇稀釋并定容至100 ml，混勻，得濃度為1 μg/ml卡馬西平內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，particle size，Waters Corp.)。流動(dòng)相：乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B)。梯度洗脫：0～0.5 min，40%→85%A；0.5～1.3 min，85%A；1.3～1.5 min，85%→40%A；1.5～2.5 min，40%A。流速：0.4 ml/min，柱溫：40 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化源(ESI)，正離子檢測(cè)模式。定量分析的離子反應(yīng)分別為：伊馬替尼：m/z494.3/394.2，N-去甲基伊馬替尼：m/z480.2/394.2，內(nèi)標(biāo)卡馬西平：m/z237.1/194.2。毛細(xì)管電壓：2 kV；伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼和卡馬西平的錐孔電壓分別為55、40、40 V，碰撞電壓分別為30、30、20 V；離子源溫度：150 ℃；去溶劑化溫度：500 ℃；本儀器用氮?dú)庾魅ト軇┗瘹怏w(800 L/h)以及錐孔氣體(50 L/h)。

2.3 血漿樣品處理方法 將保存于-80 ℃冰箱的血漿樣品置于室溫下解凍并渦旋混勻，取100 μl于1.5 ml的EP管中，加入乙腈溶劑200 μl來沉淀蛋白，再加入1 μg/ml卡馬西平甲醇溶液20 μl，并渦旋混勻2 min，置于4 ℃的離心機(jī)中，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為13 000 r/min，離心10 min，取上清100 μl與100 μl超純水(1∶1)稀釋混勻，2 μl的稀釋液注入U(xiǎn)PLC-MS/MS 系統(tǒng)進(jìn)行分析檢測(cè)。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 方法專屬性 在上述色譜和質(zhì)譜條件下，經(jīng) UPLC-MS/MS 檢測(cè)分析測(cè)得色譜圖(結(jié)果見圖1)。由圖1可見，在本實(shí)驗(yàn)條件下，各物質(zhì)之間不產(chǎn)生相互干擾，伊馬替尼、N-去甲基伊馬替尼與內(nèi)標(biāo)卡馬西平分離良好，血漿中也無內(nèi)源性物質(zhì)干擾目標(biāo)物質(zhì)出峰，方法專屬性良好；伊馬替尼的出峰時(shí)間為0.38 min，其活性代謝產(chǎn)物N-去甲基伊馬替尼的出峰時(shí)間為0.36 min，內(nèi)標(biāo)物卡馬西平的出峰時(shí)間為0.72 min。

2.4.2 線性關(guān)系及定量下線 配制濃度分別為 20、50、100、200、500、1 000、2 000、5 000、10 000 ng/ml 9個(gè)濃度梯度的伊馬替尼血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度分別為1、5、10、20、50、100、200、500、1 000 ng/ml 9個(gè)濃度梯度的N-去甲基伊馬替尼血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.3”項(xiàng)下處理后進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)定伊馬替尼峰面積As1、N-去甲基伊馬替尼峰面積As2及內(nèi)標(biāo)卡馬西平峰面積Ai。以 As1/Ai為縱坐標(biāo)(y1)、伊馬替尼對(duì)應(yīng)的各點(diǎn)濃度為橫坐標(biāo)(x1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到伊馬替尼的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y1=0.000 3 x1+0.036 3，r2=0.999 2，線性范圍為20～10 000 ng/ml，定量下限為20 ng/ml。以As2/Ai為縱坐標(biāo)(y2)、N-去甲基伊馬替尼對(duì)應(yīng)的各點(diǎn)濃度為橫坐標(biāo)(x2)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到N-去甲基伊馬替尼的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y2=0.000 07 x2+0.000 2，r2=0.999 5，線性范圍為1～1 000 ng/ml，定量下限為1 ng/ml。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取大鼠空白血漿，分別配制低、中、高3個(gè)濃度梯度的伊馬替尼血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液(50、1 000、10 000 ng/ml)和低、中、高3個(gè)濃度梯度的N-去甲基伊馬替尼血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液(20、100、1 000 ng/ml)，每種濃度6份樣品，按“2.3”項(xiàng)下處理后，并分別在同一天內(nèi)和連續(xù)3 d內(nèi)進(jìn)樣檢測(cè)，分別計(jì)算兩者的日內(nèi)、日間精密度，見表1。

2.4.4 提取回收率試驗(yàn) 取大鼠空白血漿，按“2.4.3”項(xiàng)下操作分別配制3個(gè)濃度梯度的伊馬替尼空白血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液、N-去甲基伊馬替尼空白血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每種濃度6份樣品，按“2.3”項(xiàng)下處理后進(jìn)樣檢測(cè)，記錄相應(yīng)濃度伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼的峰面積，即為血漿標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。同時(shí)取上述各相對(duì)應(yīng)濃度的伊馬替尼純標(biāo)準(zhǔn)品溶液和N-去甲基伊馬替尼純標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行分析，記錄相應(yīng)濃度伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼的峰面積，即為純標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積。提取回收率=血漿標(biāo)準(zhǔn)品峰面積/純標(biāo)準(zhǔn)品峰面積×100%，結(jié)果見表2。

圖1 伊馬替尼及N-去甲基伊馬替尼的UPLC-MS/MS色譜圖

藥名加入量(ng/ml)日內(nèi)測(cè)得量(ng/ml)RSD(%)日間測(cè)得量(ng/ml)RSD(%)伊馬替尼5049.04±4.739.6448.34±0.621.281 0001 094.02±78.017.131 092.37±16.421.5010 00010 732.65±936.358.7210 772.65±173.031.61N-去甲基伊馬替尼2020.33±2.2911.2720.22±0.160.77100112.81±8.677.68104.97±7.006.671 0001 072.86±92.448.621 063.24±11.651.10

表2 UPLC-MS/MS 法測(cè)定血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液中伊馬替尼及代謝物的回收率

2.4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取大鼠空白血漿，分別配制低、中、高3個(gè)濃度梯度的伊馬替尼空白血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液(依次為50、1 000、10 000 ng/ml)和低、中、高3個(gè)濃度梯度的N-去甲基伊馬替尼空白血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液(依次為20、100、1 000 ng/ml)，每種濃度24份樣品，等分為4組，分別置于以下4個(gè)環(huán)境處理：①室溫(25 ℃)12 h，②自動(dòng)進(jìn)樣器(4 ℃)中12 h，③3次凍融，④-20 ℃ 12 d。按“2.3”項(xiàng)下處理。結(jié)果RSD均<15%，表明血漿樣品中伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼可以被準(zhǔn)確測(cè)定。

2.4.6 基質(zhì)效應(yīng)考察 取大鼠空白血漿，分別配制低、中、高3個(gè)濃度梯度的伊馬替尼空白血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液(依次為50、1 000、10 000 ng/ml)和低、中、高3個(gè)濃度梯度的N-去甲基伊馬替尼空白血漿標(biāo)準(zhǔn)品溶液(依次為20、100、1 000 ng/ml)，每種濃度6份樣品，經(jīng)“2.3”項(xiàng)處理后，在同一日內(nèi)用UPLC-MS/MS檢測(cè)，記錄相應(yīng)濃度的伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼的峰面積，即為血漿標(biāo)準(zhǔn)品峰面積(A)；另配制上述低、中、高3種濃度梯度的伊馬替尼甲醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液和上述低、中、高3種濃度梯度的N-去甲基伊馬替尼甲醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，直接進(jìn)樣檢測(cè)，記錄相應(yīng)濃度的伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼的峰面積，即為純標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積(B)。計(jì)算不同濃度血漿標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與純標(biāo)準(zhǔn)品峰面積的比值，即基質(zhì)效應(yīng)=A/B×100%。伊馬替尼低、中、高3個(gè)濃度的平均基質(zhì)效應(yīng)分別為86.44%±10.29%、89.15%±7.74%、97.06%±7.27%；N-去甲基伊馬替尼低、中、高3個(gè)濃度的基質(zhì)效應(yīng)分別為96.08%±3.52%、101.64%±3.25%、93.95%±4.58%。

3 討論

關(guān)于血漿伊馬替尼的藥物濃度檢測(cè)，目前國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的測(cè)定方法主要有HPLC法[3-6]、LC-MS/MS法[7]、HPLC-MS法[8]、HPLC-MS/MS法[9-10]等。伊馬替尼大鼠灌胃以后，伊馬替尼血藥濃度較高，所以采用沉淀蛋白法作為血漿樣品預(yù)處理方法，不僅操作簡便，而且伊馬替尼和N-去甲基伊馬替尼的回收率也較高(均>87%)。選用的流動(dòng)相由乙腈和0.1%甲酸配制，具有較好的分離度和響應(yīng)。本研究建立的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)大鼠血漿中伊馬替尼及其活性代謝產(chǎn)物N-去甲基伊馬替尼的方法，色譜峰單一、精確度高，檢出限低，總分析時(shí)間僅需要2.5 min，可達(dá)到快速分析的目的，非常適合用于研究伊馬替尼及其活性代謝產(chǎn)物N-去甲基伊馬替尼的藥代動(dòng)力學(xué)及與其他藥物之間的相互作用。