于 淼，金素鈺，黃 林，雷杰雯，鄭玉才

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041)

富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體4(LGR4)具有廣泛的生物學(xué)功能，包括成骨、能量代謝等[1-2]，近年來被認(rèn)為參與Wnt通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3-4].LGR4和促性腺激素受體同源，與動(dòng)物生殖道發(fā)育和生殖機(jī)能相關(guān)[5-8].Qian等(2013)還報(bào)道，LGR4對(duì)精子發(fā)生是必需的[9].鑒于Wnt通路在動(dòng)物發(fā)育中的重要性，LGR4在精子發(fā)生、睪丸發(fā)育中可能有重要功能.

鋅指蛋白281(ZNF281)是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，也是胚胎干細(xì)胞的核心轉(zhuǎn)錄因子.它與Nanog等轉(zhuǎn)錄因子作用[10]，參與細(xì)胞的多功能性、干細(xì)胞和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等調(diào)控以及DNA損傷導(dǎo)致的細(xì)胞應(yīng)激[11-12].

牦牛(Bos grunniens)是青藏高原及毗鄰高寒地區(qū)特有的牛種，它與普通牛的雜交后代(犏牛)生產(chǎn)性能顯著提高，并能較好地適應(yīng)高原低氧環(huán)境，但表現(xiàn)為回交三代內(nèi)雄性不育，無法產(chǎn)生正常精子[13].因此，精子發(fā)生障礙被公認(rèn)為與犏牛的雄性不育有直接關(guān)系.有關(guān)犏牛雄性不育的分子機(jī)制已有很多研究，犏牛睪丸中很多基因表達(dá)下調(diào)，包括在減數(shù)分裂過程中起重要作用的SYCP3、Dmc1、Dmart7等基因mRNA水平均極顯著低于牦牛[13-15]，但導(dǎo)致精子發(fā)生障礙的因果關(guān)系至今尚不明確.我們前期研究發(fā)現(xiàn)，犏牛睪丸中miRNA-449水平顯著低于牦牛，而其預(yù)測(cè)靶基因中包括LGR4和ZNF281等基因(李彩霞等，待發(fā)表資料).因此，本研究采用定量PCR方法比較牦牛和犏牛睪丸LGR4和ZNF281的mRNA水平，以探索其在犏牛雄性不育中可能發(fā)揮的作用.

1 材料與方法

1.1 組織采集與處理

實(shí)驗(yàn)成年牦牛(n=10)和犏牛(n=7)的睪丸均采自成都市青白江某屠宰場(chǎng).于10月份在牦牛和犏牛屠宰后立即采集睪丸，迅速切割成小塊后置于含RNA保護(hù)液(Qiagen)的EP管中，冰上帶回實(shí)驗(yàn)室，-80℃保存?zhèn)溆?

1.2 睪丸總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

稱取睪丸約100 mg于研缽中，用液氮充分研磨，用RNAiso Reagent試劑(TaKaRa公司)根據(jù)說明書提取總RNA.利用核酸蛋白檢測(cè)儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和完整性.取1 μg總RNA按照RNA Kit(AMV)Ver.3.0(TaKaRa公司)說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存于-20℃.

1.3 基因的定量PCR檢測(cè)

根據(jù)NCBI中普通牛18S rRNA、GAPDH、LGR4和ZNF281基因的mRNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)兩個(gè)目的基因和雙內(nèi)參18S rRNA、GAPDH基因的定量PCR引物(表1)，并由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成.

表1 本研究PCR引物信息Table 1 Sequences of PCR primers in the present study

定量PCR在Bio-Rad iQ5熒光定量PCR儀上完成，反應(yīng)體系(25 μL)：SYBR?Green PCR Kit(QIAGEN 公司生產(chǎn))12.5 μL，上、下游引物各 1 μL，cDNA 1 μL，超純水9.5 μL.反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，退火(18S rRNA和GAPDH均為60℃，LGR4為64℃，ZNF281為65℃)20 s，72℃ 15 s，共40個(gè)循環(huán).

以反轉(zhuǎn)錄獲得的牦牛睪丸cDNA為模板，用4對(duì)定量PCR引物分別進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)10倍稀釋(10-4～10-8)的5個(gè)梯度作為模板，進(jìn)行反應(yīng)體系和條件優(yōu)化，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得融解曲線、線性范圍等參數(shù).進(jìn)一步利用建立的定量PCR方法，對(duì)牦牛和犏牛睪丸樣品中目的基因和2個(gè)內(nèi)參基因進(jìn)行定量.樣品均做兩管平行，并設(shè)無模板對(duì)照.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤表示.采用 SPSS 18.0軟件，根據(jù)兩個(gè)內(nèi)參基因18S rRNA和GAPDH表達(dá)水平的幾何平均數(shù)，對(duì)LGR4和ZNF281 mRNA表達(dá)水平分別進(jìn)行矯正，并以2-ΔΔCt法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理[16].

2 結(jié)果

2.1 總RNA提取和定量PCR方法建立

實(shí)驗(yàn)提取的睪丸總 RNA的 A260/A280為1.8～2.0，瓊脂糖凝膠電泳顯示清晰的條帶，且28S rRNA條帶亮度是18S rRNA的約2倍，質(zhì)量符合定量PCR分析的要求.常規(guī)PCR擴(kuò)增顯示，LGR4和ZNF281基因的PCR產(chǎn)物均為特異的單一條帶，與預(yù)期分子量大小一致.

建立的定量PCR方法中，4個(gè)基因在較寬范圍內(nèi)均有很好的線性關(guān)系，其中LGR4和ZNF281基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.994，擴(kuò)增效率分別為96.1%和104%，融解曲線均只有1個(gè)峰(圖1)，表明擴(kuò)增特異性強(qiáng)，符合定量PCR分析要求.

圖1 LGR4基因(A)和ZNF281基因(B)的融解曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Melting curves and standard curves for LGR4 gene(A)and ZNF281 gene(B)

2.2 牦牛和犏牛睪丸LGR4和ZNF281 mRNA水平的比較

定量PCR分析表明：LGR4和ZNF281基因在牦牛和犏牛睪丸中均有較高表達(dá).牦牛和犏牛睪丸中LGR4 mRNA水平差異不顯著，而牦牛睪丸中ZNF281 mRNA水平極顯著高于犏牛(P＜0.01)，相差約4.7倍(圖2).

圖2 牦牛和犏牛睪丸中LGR4基因和ZNF281基因的mRNA水平Fig.2 mRNA levels of LGR4 gene and ZNF281 gene in the testes of yaks and cattle-yaks

3 討論

犏牛睪丸無法產(chǎn)生正常的精子.已有研究表明，雄性不育犏牛睪丸中很多與繁殖相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)[13-15，17].利用轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，也檢測(cè)到牦牛和犏牛睪丸中眾多差異表達(dá)基因[18-19].有報(bào)道LGR4對(duì)精子發(fā)生是必需的[9].本研究中牦牛和犏牛睪丸LGR4 mRNA水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異(圖2A)，推測(cè)該基因可能不是導(dǎo)致犏牛雄性不育的主要原因.精子發(fā)生涉及復(fù)雜的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，我們?cè)l(fā)現(xiàn)犏牛睪丸中MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的信號(hào)分子表達(dá)顯著下調(diào)[20].由于LGR4與Wnt信號(hào)通路有關(guān)，推測(cè)犏牛睪丸中該通路與精子發(fā)生障礙的直接關(guān)系不大.

鋅指蛋白基因是哺乳動(dòng)物基因組中最大的基因家族之一，其中一些在睪丸中表達(dá)水平高，并與精子發(fā)生相關(guān)，如 ZFP393、ZNF313、ZNF230 等[21-23].有關(guān)ZNF281的研究很少，它是重要的轉(zhuǎn)錄因子，在干細(xì)胞的分化中發(fā)揮重要作用[24].犏牛睪丸中ZNF281基因表達(dá)顯著降低，有可能通過影響睪丸中的細(xì)胞分化而影響精子的發(fā)生，導(dǎo)致雄性不育.上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是組織細(xì)胞發(fā)育中的重要機(jī)制，ZNF281可被該過程誘導(dǎo)，但被miR-34a抑制[11].犏牛睪丸細(xì)胞組成與牦牛不同[25]，可能是導(dǎo)致其ZNF281基因表達(dá)下調(diào)的主要原因.我們過去的研究也表明，另外一種鋅指蛋白Prdm9在犏牛睪丸中的表達(dá)也顯著下降[25]，提示雄性不育犏牛睪丸中的信號(hào)通路存在障礙.至于牦牛睪丸miRNA-449水平與ZNF281基因表達(dá)的關(guān)系需要證實(shí).根據(jù)本研究結(jié)果，推測(cè)ZNF281基因在犏牛精子發(fā)生中可能有作用.