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神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞的腦部惡性腫瘤，是最常見的顱內(nèi)腫瘤，盡管目前在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷、外科手術(shù)以及放化療上取得了很大的進步，但是目前神經(jīng)膠質(zhì)瘤在治療上仍面臨著很大的困難，預(yù)后較差。就目前而言，神經(jīng)膠質(zhì)瘤病人接受廣泛外科手術(shù)切除和術(shù)后輔助放化療后平均生存期時間在14.6個月左右[1]。然而，最近10年在惡性膠質(zhì)瘤細胞生物學的研究上大大提高了對惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生機制的認識，特別是神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞，它是一個罕見的具有腫瘤干細胞特點的族群，這可能對研究惡性膠質(zhì)瘤治療后復(fù)發(fā)有幫助，和干細胞相似，神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞具有自我更新復(fù)制能力，耐放療及耐化療，而且在大腦里面有侵襲轉(zhuǎn)移能力以及很高的增殖潛能。少量神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞經(jīng)過治療后幸存下來并快速增殖，重新形成膠質(zhì)瘤[2]。因此，最新的抗膠質(zhì)瘤治療研究進展中旨在消除膠質(zhì)瘤干細胞，防止惡性膠質(zhì)瘤的復(fù)發(fā)。神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞可能在腫瘤發(fā)生和腫瘤的復(fù)發(fā)中發(fā)揮著重要作用，找到能徹底殺滅神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的方法，消除這種神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞種群，可能給臨床治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤帶來新的希望。因此，對神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的功能分析和發(fā)病機制進行詳細的了解至關(guān)重要。這些發(fā)現(xiàn)為神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的生物學特性和對腦部腫瘤靶向治療提供了一個開放的新視角。本實驗經(jīng)過分離提取并鑒定神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞，對后期神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生機制、治療及取得良好的治療效果進行前期研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 標本 十堰市太和醫(yī)院神經(jīng)外科術(shù)中的神經(jīng)膠質(zhì)瘤，術(shù)后病理診斷為間變型星形膠質(zhì)細胞瘤，WHOⅢ級，IHC：GFAP(+)，S-100(+)，NeuN(-)，Ki-67(20%)。

1.2 實驗方法 病人術(shù)前未行放化療和手術(shù)。取5個位點的腦腫瘤組織各1塊，直徑(5～10) mm，浸入無菌2 mL 無血清DMEM/F12培養(yǎng)液瓶中保鮮，外加無菌敷料嚴密包被，立即于30 min內(nèi)送實驗室進行分離培養(yǎng)。吸出標本瓶中上層液體，加入0.05%的胰蛋白酶2 mL于標本瓶中，吸引管反復(fù)吹打混勻消化后，移入培養(yǎng)皿中，剪刀反復(fù)剪碎，剪成更小組織碎片，玻片反復(fù)研磨，10%FBS終止消化；吸引管反復(fù)吹打，重懸，混勻后200篩網(wǎng)過濾，然后將過濾后的液體于離心機上以1 000 r/min離心5 min，去上清。再用PBS液反復(fù)洗滌3次，離心后去上清。制成單細胞懸液，最后將細胞濃度調(diào)整為(0.5～1.0)×108個/mL，于多聚賴氨酸預(yù)處理過的六孔板上分別種植單細胞懸液，將細胞種植在每一孔中，加入含有神經(jīng)生長因子(20 ng/mL，bFGF、20 ng/m，EGF；2%B27)和雙抗無血清DMEM/F12培養(yǎng)液18 mL，放入含有5%的二氧化碳(CO2)、37 ℃常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，據(jù)細胞的生長形態(tài)和速度以及培養(yǎng)基pH的高低來觀察，進行換液(3 d～4 d 1次)。然后進行定期傳代培養(yǎng)。取傳代培養(yǎng)第3代生長良好的膠質(zhì)瘤干細胞進行Nestin、CD133的免疫熒光化學檢測，然后利用倒置熒光顯微鏡觀察拍照。在膠質(zhì)瘤干細胞的對數(shù)生長期，選取生長良好的細胞，制成膠質(zhì)瘤干細胞懸液，然后將細胞懸液種植在預(yù)冷的無菌玻片上，依此制作6張玻片，室溫下靜置晾干。于75 ℃環(huán)境下烘烤玻片1 h，然后進行G帶染色。顯微拍照攝影，于放大后進行膠質(zhì)瘤干細胞的染色體核型分析。利用CD133細胞磁珠分離技術(shù)使CD133正負細胞被洗滌分離。 取免疫磁珠分選系統(tǒng)分離的CD133+細胞，調(diào)整細胞計數(shù)為1×106個，加入40 μL 0.01 mol/L的PBS液和CD133抗體，混合均勻后放入4 ℃環(huán)境中靜置10 min，加入300 μL 0.01 mol/L的PBS液，分9次送流式細胞儀檢測CD133+細胞的表達。

2 結(jié) 果

2.1 培養(yǎng)出神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞 細胞培養(yǎng)第3天開始出現(xiàn)細胞球(見圖1)，5 d～7 d之后逐漸形成大量細胞球，每個球包含(4～8)個細胞，細胞球呈現(xiàn)球形或橢圓形的外表，內(nèi)部細胞排列整齊嚴密，并且折光性好。2周內(nèi)，大多數(shù)區(qū)域的細胞球增加到它們直徑的(5～10)倍。部分細胞球出現(xiàn)突起，呈放射狀生長，形態(tài)多不規(guī)則，可見有星形、多角形、樹枝狀。3 d換液1次，然后視細胞球生長情況進行傳代，(7～9)天/次(見圖2)。每次傳代前，于顯微鏡下培養(yǎng)皿中可見懸浮的結(jié)構(gòu)在培養(yǎng)液中搖擺，此即神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞，一般于每次傳代后(1～2)d就可看到神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的形成，隨著培養(yǎng)時間慢慢地延長，形態(tài)與原代大致相同。

圖1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞原代培養(yǎng)第3天

圖2 顯微照相傳代后形成的神經(jīng)球(100×)

2.2 神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞團的免疫熒光染色 懸浮的細胞免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示Nestin、CD133染色陽性(見圖3和圖4)，而培養(yǎng)皿底部貼壁的細胞Nestin、CD133染色均呈現(xiàn)陰性。

CD133染色為陽性，呈紅色，用DAPI紫色復(fù)染

圖3神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞團的免疫熒光染色顯示(100×)

Nestin染色為陽性圖4 神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞團的免疫熒光染色(200×)

2.3 神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的染色體核型分析 神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞和正常的神經(jīng)干細胞在干細胞功能和生物學特征上有許多相似之處，為了對培養(yǎng)的細胞球進行區(qū)分，對所培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤干細胞球進行了染色體核型分析檢測，進一步證實該細胞球的性質(zhì)，結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤干細胞球的細胞核染色體均為非整倍體，即異倍體，且其中有部分染色體呈現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，染色體上存在部分基因片段的缺失(見圖5)。染色體核型分析結(jié)果為：45XY，-10，del(5)(p15)，del(16)(p；q)。

圖5 神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞球的染色體核型檢查G顯帶

2.4 流式細胞儀檢測CD133+神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞(見表1) 經(jīng)免疫磁珠分選系統(tǒng)分離后，通過流式細胞儀得到CD133+細胞在總分離后細胞數(shù)的比例為(86.83±5.12)%，獲得了高純度的CD133+神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞(見圖6)。

3 討 論

在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療中，新的治療方法顯得非常重要，神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞是目前研究的熱點，可能為治療膠質(zhì)瘤提供新的途徑[3]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞是一種在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中罕見的具有腫瘤干細胞特點的族群，和干細胞很相似，膠質(zhì)瘤干細胞具有自我更新復(fù)制、耐放療及耐化療能力，在大腦內(nèi)有生長迅速、轉(zhuǎn)移能力強等特點。神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞是Ignatova等在使用一個神經(jīng)細胞球進行實驗時第一個分離出來的[4-6]。原發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞(分離成單個細胞)在無血清培養(yǎng)基和神經(jīng)干細胞生長因子bFGF、EGF和B27中進行原代培養(yǎng)，顯示0.3%～25.1%的膠質(zhì)瘤細胞腫瘤級別愈高越能夠繼續(xù)增殖，并隨著時間的推移在培養(yǎng)皿中生長。這些神經(jīng)球形成的細胞，即神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞，它表達的標記物主要有巢蛋白Nestin和CD133。本研究中用巢蛋白Nestin和CD133抗體進行免疫熒光染色，對神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞進行了鑒定。

表1 CD133+細胞的純度 %

A曲線是分選之前CD133+的百分比，B曲線是分選之后CD133+的百分比

圖6原代膠質(zhì)瘤細胞培養(yǎng)的細胞總?cè)褐蠧D133+百分比

巢蛋白是一種新發(fā)現(xiàn)的第Ⅵ類中間絲蛋白，表達豐富，能夠特異性地表達在神經(jīng)上皮干細胞上的一種細胞標記物，也被廣泛用作神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的標記物檢測。在正常的細胞變成腫瘤細胞的過程中，巢蛋白的表達受其內(nèi)在的細胞基因調(diào)控元件和激素受體-配基復(fù)合物以及轉(zhuǎn)錄因子等因素調(diào)控，可能對神經(jīng)元的分化有作用。巢蛋白已經(jīng)在原發(fā)的中樞神經(jīng)腫瘤中檢測到，而轉(zhuǎn)移癌中則沒有[7]。本研究對懸浮的細胞球進行了免疫熒光染色檢測，結(jié)果顯示Nestin染色陽性，說明所培養(yǎng)的細胞表達了Nestin，因此證明培養(yǎng)中的懸浮細胞具有干細胞源性。

CD133是干細胞表面抗原的一種，是一種糖蛋白，最早在造血干細胞中找到這種抗原，隨后發(fā)現(xiàn)在許多實體腫瘤中如結(jié)腸癌、胰腺癌、肺癌、骨肉瘤以及腦腫瘤中均有發(fā)現(xiàn)[8]。許多研究表明，CD133可被用作神經(jīng)干細胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的共有細胞標記物，是目前在人類膠質(zhì)瘤干細胞研究最多和經(jīng)常使用的標記，被認為是神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞最重要的標記物。CD133細胞分為CD133+和CD133-細胞兩種，CD133+細胞在腫瘤中的比例與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。CD133+神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞具有很強的自我更新復(fù)制能力、致瘤能力、分化能力、耐藥以及耐放化療能力，而CD133-神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞則沒有這方面的能力[9]，因此對研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞具有很好的指導(dǎo)作用和研究前景。本實驗在做流式細胞儀檢測目標細胞時基本大部分為CD133+細胞，而CD133-細胞則很少或沒有，由此說明CD133+細胞具有很強的生長能力，CD133+細胞的數(shù)量可能與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)的，其比例越高，預(yù)后則越差。

神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞與正常的神經(jīng)干細胞之間有許多相似之處。神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞表達了標記物CD133，巢蛋白Nestin，Sox2MELK等等，所有這些在成人神經(jīng)干細胞中也表達了。此外CD133+神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞在培養(yǎng)中能夠增殖形成神經(jīng)球，與在相同培養(yǎng)條件下正常神經(jīng)干細胞一樣，而貼壁在培養(yǎng)皿的CD133-神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞沒有增殖形成神經(jīng)球體[10]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞和正常干細胞的一個共同特征是都具有自我復(fù)制更新功能。另一個的共同點是具有多分化潛能性。神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞究其來源，多數(shù)學者們認為其源于發(fā)生基因突變的神經(jīng)干細胞[11]。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞和神經(jīng)干細胞同樣都表達了細胞標記物CD133，巢蛋白Nestin。本實驗對培養(yǎng)液中懸浮生長的細胞球進行了免疫細胞化學熒光染色，檢測結(jié)果顯示Nestin、CD133染色陽性，說明細胞球表達了細胞標記物Nestin、CD133，所以還不能完全肯定該細胞就是神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞，有可能是神經(jīng)干細胞，只是初步認為該細胞為神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞，本研究對該細胞進行染色體核型檢查及分析最終鑒定該細胞為人腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞。

免疫磁珠分選法是目前最新的針對CD133+細胞的分選方法，利用磁力學的原理將目標細胞(CD133+細胞)進行分離出來，而且所選用的磁珠也是目前被廣為接受的復(fù)合磁珠，即磁珠標記結(jié)合的CD133抗體，在傳統(tǒng)的實驗中需要將磁珠與CD133抗體進行結(jié)合，這種復(fù)合磁珠既加快了實驗的進程，又提高了實驗的準確性。通過免疫磁珠分選法成功分離得到高純度的CD133+神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞，在實驗上具有很強的可行性，受外部條件影響較小，分離得到的純度也很高，相比較其他如條件培養(yǎng)等分離方法更易獲得目標細胞。但是目前在購買實驗試劑和高新儀器上，如熒光染色劑結(jié)合的特異性抗體、免疫磁珠分選系統(tǒng)以及分離所選用的磁珠標記結(jié)合的CD133抗體價格較貴，實驗研究的投入相對較大。

本實驗從免疫熒光染色和染色體核型檢查及分析上對神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞進行了鑒定，后期將從基因水平的檢測來對神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞進行深入研究。神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的研究還有許多需要解決的問題，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的起源問題、特異性標志，對神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞運用到臨床上治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤等等。針對神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞的研究，大部分還處在實驗研究階段的早期，更深入地研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生物學特性非常必要，研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞將為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療提供新的途徑。