， ， ，，，，

心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的損傷是急性心肌梗死溶栓和介入治療中經(jīng)常伴隨的一種病理?yè)p傷[1-2]。芪參益氣滴丸對(duì)心肌缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。據(jù)研究顯示，芪參益氣滴丸可增加缺血心臟組織的能量代謝物質(zhì)三磷酸腺苷(ATP)的含量，從而改善腦缺血后發(fā)生的能量代謝障礙[3]。芪參益氣滴丸可以減少心肌細(xì)胞凋亡，抑制炎癥反應(yīng)發(fā)生，間接保護(hù)心肌缺血再灌注損傷。本研究通過(guò)建立心肌缺血再灌注損傷模型，研究芪參益氣滴丸對(duì)心肌缺血再灌注大鼠炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，以期為進(jìn)一步深入研究提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 選取雄性大鼠120只，體質(zhì)量為(199.2±23.2)g，購(gòu)于本直屬大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、Ⅱ型膠原酶、胰蛋白及酶基質(zhì)膠與Mdivi-1(美國(guó)Sigma公司)；白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)試劑盒(上海玉博生物科技有限公司提供)；芪參益氣滴丸購(gòu)于天士力制藥集團(tuán)股份有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字Z200330139，規(guī)格為5 g，用于試驗(yàn)組的使用)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定[4]選取培育成熟的雄性大鼠進(jìn)行內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)。首先采用腹腔注射的方式將3 g/L戊巴比妥鈉進(jìn)行注射麻醉后，于無(wú)菌條件下取出試驗(yàn)大鼠的左心室，注意將其放于磷酸鹽緩沖溶液(PBS)試管中，沖洗干凈；然后剪碎心肌組織，加入75%乙醇滅活30 s，加入等體積的2.5 g/L的Ⅱ型膠原酶后，37 ℃水浴中消化反應(yīng)5 min。結(jié)束后加入等體積2.0 g/L胰蛋白酶進(jìn)行反應(yīng)，相同溫度條件下消化反應(yīng)10 min，然后加入等體積含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行中和反應(yīng)，將此反應(yīng)終止。靜置，離心，棄上清液，將細(xì)胞重新完全懸在培養(yǎng)液中，在培養(yǎng)皿上進(jìn)行接種，37 ℃溫度，2%二氧化碳孵化箱中恒溫培養(yǎng)6 h。收集細(xì)胞，取第2代、第3代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 血管環(huán)試驗(yàn) 大鼠用木槌擊暈后行頸部脫臼，打開(kāi)胸腔，迅速取出胸主動(dòng)脈條上段，置于4 ℃的K11溶液中。小心剔除其周圍結(jié)締組織后，將血管剪成3 mm長(zhǎng)的主動(dòng)脈環(huán)，迅速懸掛至5 mL離體灌流裝置中。然后按照1.2.1的操作步驟操作。

1.2.3 建立缺血/再灌注模型[5]大鼠稱重后進(jìn)行麻醉，將其仰臥并固定于手術(shù)臺(tái)上，建立缺血/再灌注模型試驗(yàn)。首先建立模擬缺血，采用純氮?dú)獬掷m(xù)通氣，時(shí)間為40 min，測(cè)定血氧分壓小于40 kPa即為模擬缺血。采用純氧氣持續(xù)通氣大于40 min，即為模擬再灌注；或也可以采用缺血液培養(yǎng)液建立模擬缺血，缺血液培養(yǎng)液配制按照參考文獻(xiàn)[6]進(jìn)行配制，pH=6.5，37 ℃缺氧孵箱內(nèi)孵育2 h，即為模擬缺血。更換正常培養(yǎng)液，37 ℃ 5% CO2孵箱內(nèi)孵育4 h即為模擬再灌注。

1.2.4 試驗(yàn)分組 120只大鼠分為對(duì)照組、缺血/再灌注模型組、試驗(yàn)組，每組40只。試驗(yàn)組和缺血/再灌注模型組大鼠按“1.2.3”建立的缺血/再灌注模型進(jìn)行建模，缺血2 h，再灌注4 h，再灌液10 g。試驗(yàn)組給予5 g芪參益氣滴丸，缺血/再灌注模型組給予生理鹽水；對(duì)照組不做任何處理。芪參益氣滴丸5 g可以達(dá)到最佳的效果[7]。

1.2.5 人體試驗(yàn) 選取有心血管疾病的病人2例，按照缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞試驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)操作進(jìn)行人體試驗(yàn)，觀察細(xì)胞情況。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 MTT比色法測(cè)定心肌細(xì)胞活性[6]取同一批分離的心肌細(xì)胞，接種后進(jìn)行復(fù)氧處理1 h。復(fù)氧結(jié)束后，加20 μL的 MTT培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)4 h，待結(jié)晶物被溶解后采用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，在波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)各組的吸光度(A)值作為心肌細(xì)胞活性。

1.3.2 TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率[8]收集心肌活細(xì)胞，按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，顯示綠色熒光為細(xì)胞凋亡。采用DAPI對(duì)采集的細(xì)胞核進(jìn)行染色，對(duì)每張呈現(xiàn)藍(lán)色熒光的圖選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)為80個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)內(nèi)皮細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞凋亡率=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.3 放射免疫法檢測(cè)炎癥因子 采集3組大鼠的心肌血3 mL，嚴(yán)格按照IL-6、TNF-α試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞增殖活性比較 與對(duì)照組比較，缺血/再灌注模型組、試驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力明顯降低；試驗(yàn)組與缺血/再灌注模型組比較，試驗(yàn)組細(xì)胞增殖能力明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞增殖活性比較

2.2 各組心肌細(xì)胞的凋亡率比較 與對(duì)照組比較，缺血/再灌注模型組、試驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯增加；與缺血/再灌注模型組比較，試驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率明顯降低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表1。

表1 各組心肌細(xì)胞的凋亡率比較(±s)

2.3 各組炎癥因子表達(dá)能力比較 與對(duì)照組比較，缺血/再灌注模型組IL-6水平表達(dá)明顯升高，TNF-α明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與缺血/再灌注模型組比較，試驗(yàn)組IL-6表達(dá)明顯降低，TNF-α表達(dá)明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表2。

表2 各組IL-6、TNF-α的比較(±s)

3 討 論

急性心肌梗死是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病，其斑塊的形成是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。采用不同的藥物治療可以減少心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，芪參益氣滴丸對(duì)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)功效。

缺血性心肌細(xì)胞損傷主要以心肌細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡兩種細(xì)胞死亡形式存在[9]。因此將細(xì)胞凋亡作為重要指標(biāo)對(duì)缺血性心肌細(xì)胞損傷進(jìn)行分析，可以反映心肌組織的情況，而心肌細(xì)胞凋亡受到多種基因與蛋白調(diào)控[10]。通過(guò)細(xì)胞活性和凋亡的研究可以判定不同藥物對(duì)缺血性心肌損傷的作用，從而為進(jìn)一步治療提供可靠依據(jù)。黃芪甲苷、丹參素、原兒茶醛、人參皂苷作為芪參益氣滴丸中的重要成分，對(duì)人體的大腦、心臟、腎臟等重要器官的缺血損傷起到抑制作用。據(jù)研究報(bào)道顯示，采用芪參益氣滴丸可以增加缺血性心肌細(xì)胞損傷的細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞增殖活性[11]。本研究結(jié)果也支持此論斷，芪參益氣滴丸可以對(duì)缺血/再灌注誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷起到保護(hù)作用。

芪參益氣滴丸除了抗疲勞、抗輻射、抑制炎癥反應(yīng)等功效外，更多的研究顯示其對(duì)細(xì)胞的損傷有保護(hù)抑制作用。其主要原因是芪參益氣滴丸參與了細(xì)胞中相關(guān)蛋白的反應(yīng)[12]。也有研究顯示芪參益氣滴丸可以增加心肌細(xì)胞中各種蛋白的表達(dá)，芪參益氣滴丸的適量添加，提高了心肌缺血后心肌組織對(duì)氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用[13]。

炎癥反應(yīng)在心力衰竭發(fā)生時(shí)刺激心肌細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子，心肌局部促炎癥細(xì)胞因子生成的重要來(lái)源主要是心肌細(xì)胞、心肌成纖維細(xì)胞，最為重要的是中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞[14]。發(fā)生心力衰竭與IL-6、TNF-α的濃度水平密切相關(guān)[15]，因此本研究將IL-6、TNF-α作為重要指標(biāo)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示芪參益氣滴丸可以有效降低IL-6、TNF-α水平，起到抗炎癥的作用。

本研究通過(guò)建立缺血再灌注損傷模型，對(duì)試驗(yàn)組、缺血/再灌注模型組與對(duì)照組進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)芪參益氣滴丸可以降低細(xì)胞增殖能力，增加細(xì)胞凋亡率能力，增加IL-6、TNF-α表達(dá)能力，減少心肌缺血后心臟組織的損傷，從而起到對(duì)缺血再灌注誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。芪參益氣滴丸可減輕缺血再灌注的心肌細(xì)胞損傷，主要通過(guò)抗炎和抗細(xì)胞凋亡途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)保護(hù)作用。