曹衛(wèi)，徐陽鑫，賀婷，陳媛媛，馮年捷，吳茜*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，武漢 430068；2.工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430068；3.湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，武漢 430068；4.湖北工業(yè)大學(xué) 材料與化學(xué)工程學(xué)院，武漢 430068)

發(fā)酵食品是指人們利用有益微生物加工制造的一類食品，常見的發(fā)酵食品主要有乳類發(fā)酵制品、谷物發(fā)酵制品和豆類發(fā)酵制品，并且它們的消耗量大，是人們經(jīng)常食用的一類食品，其富含氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、糖類等營養(yǎng)物質(zhì)，對人體健康有很大的益處。但是，在發(fā)酵過程中很容易發(fā)生美拉德反應(yīng)從而產(chǎn)生AGEs，如CML就是其中的一種，這些物質(zhì)在人體內(nèi)大量積累會對人體造成潛在的危害，因此，了解發(fā)酵食品中CML的形成和對其進行控制至關(guān)重要。

美拉德反應(yīng)主要指食品中的氨基化合物與羰基化合物之間發(fā)生的復(fù)雜反應(yīng)[1]，在非酶促條件下，還原糖(主要是葡萄糖)的醛基和蛋白質(zhì)、氨基酸、脂類等大分子物質(zhì)的游離氨基發(fā)生羰氨反應(yīng)，經(jīng)過脫水縮合、聚合、裂解、氧化修飾后產(chǎn)生一組穩(wěn)定的AGEs[2]。食品中的AGEs主要通過美拉德反應(yīng)和脂質(zhì)氧化過程形成[3]，但是在發(fā)酵食品中也能夠發(fā)現(xiàn)一定量的AGEs。AGEs包含的種類很多，除了CML外，還含有羧乙基賴氨酸(Nε-(Carboxyethyl)lysine，CEL)和吡咯素等[4]。只有對AGEs這一類化合物形成的條件進行深入的研究，并找出相應(yīng)條件影響其形成反應(yīng)速率的規(guī)律，才能更加有效地控制其在發(fā)酵食品中的含量。

1 CML的介紹及測定方法

1.1 CML的介紹

在與美拉德反應(yīng)相關(guān)的檢測AGEs的研究中，CML因為具有易標(biāo)記、易檢測的特點，作為在食品加工過程中出現(xiàn)美拉德反應(yīng)時體內(nèi)還原糖氧化或者修飾蛋白，羰基化合物形成或脂質(zhì)氧化的重要標(biāo)記產(chǎn)物，所以食品體系中總AGEs含量的高低就由CML含量的高低來評價。CML廣泛存在于日常生活中，常見的如老抽、黃酒、豆豉等發(fā)酵食品中，被消化吸收后蓄積在肝臟、神經(jīng)細(xì)胞、心肌等組織器官中，會導(dǎo)致一些疾病的發(fā)生。CML的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 CML的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

形成CML的途徑非常復(fù)雜，有廣泛的底物來源，可作為形成CML的底物如蛋白質(zhì)、還原糖、脂質(zhì)和抗壞血酸等[5]。在發(fā)酵食品生產(chǎn)加工過程中CML很容易形成，它的形成是多種因素共同作用的結(jié)果，CML的形成不僅是單一的一條途徑，而且由不同途徑最終形成。

1.2 CML的測定方法

目前，CML的檢測方法有很多，主要有酶聯(lián)免疫法(ELISA)[6]、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法和超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)法。

1.2.1 酶聯(lián)免疫法(ELISA)

ELISA法是基于免疫學(xué)原理且在檢測AGEs方面應(yīng)用已很廣泛，其基本原理主要是通過抗體(單克隆與多克隆)與待測物、固相抗原發(fā)生競爭結(jié)合反應(yīng)來測定目標(biāo)物含量。ELISA是一種快速、價廉、操作簡便的CML檢測方法，近年來，ELISA在食源性CML的檢測中得到逐步應(yīng)用。Teresia等[7]采用ELISA法對500余種食品中的CML進行檢測，從檢測結(jié)果來看，食品自身的營養(yǎng)成分和食品制作時的加工工藝對AGEs的產(chǎn)生會有非常大的影響。發(fā)酵食品富含蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分，在發(fā)酵過程中易形成CML；而且CML隨溫度的升高而升高，一些發(fā)酵食品在發(fā)酵過程中也會涉及到高溫的過程，在高溫過程中就會積累大量的CML。ELISA法雖然具有上述提到的操作方式簡便、花費時間少、成本低的優(yōu)點，卻也有許多缺點，例如最終結(jié)果沒有標(biāo)準(zhǔn)的單位來反映；另外，ELISA法在檢測過程中每個化合物都需要有特異性抗體來競爭結(jié)合，并且檢測時樣品的基質(zhì)會影響特異性檢測的結(jié)果，最終會導(dǎo)致CML含量的測定結(jié)果不夠精確。

1.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)法

GC-MS法作為一種檢測食源性CML的儀器分析方法，具有高分辨率、高靈敏度、高效的優(yōu)點；但同時也有許多缺點，在應(yīng)用GC-MS法時，除需要對食品樣品進行繁瑣的前處理步驟外，還需對樣品進行衍生化處理，這些操作若沒有完成或者存在操作錯誤，都會導(dǎo)致最終結(jié)果的不準(zhǔn)確性，但不得不承認(rèn)GC-MS法在檢測CML的含量方面具有獨到之處。Charissou等[8]在檢測食源性CML的研究中，對食品樣品首先進行脫脂、酸水解處理得到游離態(tài)CML，而后對CML進行衍生化處理，即利用三氟乙酸酐衍生化CML上的氨基，利用甲醇在強酸條件下酯化CML上的羧基，最后用GC-MS法檢測衍生化后的CML，所測得的結(jié)果較為準(zhǔn)確，此法比ELISA法的精確性高。

1.2.3 超高效液相色譜-質(zhì)譜(UPLC-MS)法

如今，超高效液相色譜(UPLC)法也應(yīng)用于檢測食品中的CML，與質(zhì)譜儀聯(lián)用后，UPLC-MS法的靈敏度、選擇性和速度比高效液相色譜(HPLC)法優(yōu)得多。所以，為了進一步提高精確性、選擇性和靈敏性，在檢測食品樣品中的CML時，UPLC與質(zhì)譜儀串聯(lián)使用。檢測食品中CML含量的UPLC-MS法是由Assar等[9]創(chuàng)立的，運用此方法對許多食品樣品進行過檢測，應(yīng)用廣泛。而且質(zhì)譜儀的檢出限較低，加上監(jiān)測的模式多，能同時定量分析體系中的不同種物質(zhì)。

2 加工條件對發(fā)酵食品中羧甲基賴氨酸的影響

2.1 溫度對CML的影響

加熱溫度通過影響反應(yīng)物的活性而影響CML的形成，在此基礎(chǔ)上，較高的溫度還能加快果糖降解的速率，從而產(chǎn)生更多的C2，C3活性碎片，而這些碎片較果糖有更高的反應(yīng)活性，它們隨體系加熱溫度的升高而增加，造成CML的含量也隨之增多；因此，控制加熱溫度對于抑制CML的形成有重要作用[10]。

周建弟等[11]在研究中發(fā)現(xiàn)，溫度對美拉德反應(yīng)的影響較大，一般溫度在30 ℃以上，其反應(yīng)速度較快；若溫度相差10 ℃，其反應(yīng)速度可相差3～5倍；而在20 ℃以下，溫度的波動則對美拉德反應(yīng)的影響不太明顯。黃酒也是發(fā)酵產(chǎn)品的一種，在各個釀造階段的過程中，所需的溫度比較高，較高的溫度條件非常有利于加快美拉德反應(yīng)的速率，從而形成較多的CML。孫佳賀等[12]在對白湯醬油儲藏期間褐變與美拉德反應(yīng)的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，低溫儲藏能明顯抑制白湯醬油顏色變深，是因為低溫可以抑制美拉德反應(yīng)形成CML。

2.2 pH對CML的影響

在CML反應(yīng)體系中，pH對反應(yīng)底物的活性影響很大，如賴氨酸的脫質(zhì)子化、反應(yīng)物果糖的開環(huán)式等活化形式會隨pH的升高而增強，從而使美拉德反應(yīng)速率加快。劉春霞等研究發(fā)現(xiàn)，在CML反應(yīng)體系中，酸堿條件會影響反應(yīng)體系產(chǎn)生的自由基的活性，而實驗證實活性更強的自由基產(chǎn)生在堿性環(huán)境下，因此CML的形成在堿性條件下更容易。周燕瓊[13]在研究中發(fā)現(xiàn)，在果糖與賴氨酸體系中，隨著反應(yīng)的進行，堿性賴氨酸的消耗導(dǎo)致pH降低，賴氨酸的脫質(zhì)子化、反應(yīng)物果糖的開環(huán)式等活化形式程度降低，減緩了反應(yīng)速率。

劉曉庚等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)，在弱酸性條件下有利于美拉德反應(yīng)的進行，從而造成CML的積累，氨基酸和還原糖在強酸和強堿環(huán)境下分解速率加快，分解程度加深，而且強酸和強堿還會破壞美拉德反應(yīng)生成的產(chǎn)物。周建弟等在研究中發(fā)現(xiàn)，酒體pH值對反應(yīng)的影響表現(xiàn)在當(dāng)糖類與氨基酸共存時，pH>3時，其反應(yīng)速度隨pH值的升高而加快。魏桃英等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)，美拉德反應(yīng)可以在任何酸堿環(huán)境中包括中性條件下發(fā)生，但pH>3時，隨著pH的增加，反應(yīng)速率會隨之增大；因此，在黃酒釀造過程中要確保pH在3.5～4.8之間，其原因是保證該酸性條件下對美拉德反應(yīng)的促進作用。

2.3 時間對CML的影響

因為美拉德反應(yīng)極其復(fù)雜，存在很多可逆反應(yīng)，在一定的溫度條件下，隨著加熱時間的延長，CML含量先上升后基本不變，反應(yīng)后期可逆反應(yīng)達(dá)到平衡狀態(tài)。因此在食品熱加工過程中，盡量減少食品的加熱時間，減少食品的加工步驟，可有效減少食品中CML的含量，同時，要盡早食用加工好的成品。

魏桃英等研究發(fā)現(xiàn)，紹興黃酒在生產(chǎn)過程中，在一定條件下，溫度越高、時間越長，美拉德反應(yīng)越強烈。例如在瓶裝酒殺菌過程中，由于反應(yīng)底物充足，會進一步發(fā)生美拉德反應(yīng)，加之這一過程持續(xù)時間比較長，反應(yīng)更加劇烈。

3 羧甲基賴氨酸的控制方法

3.1 發(fā)酵食品中底物對CML形成的控制方法

3.1.1 反應(yīng)底物中蛋白質(zhì)對CML的控制

蛋白質(zhì)作為形成CML的主要底物，在對食品熱處理的過程中，CML的形成會因其種類和數(shù)量的差別而產(chǎn)生較大的差異，尤其是不同種類的蛋白質(zhì)對CML含量的影響尤為明顯，并通過實驗證明了在谷蛋白、酪蛋白、大豆蛋白和牛血清蛋白4種蛋白質(zhì)中，形成CML的量會依次增高。當(dāng)以丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸以及天冬氨酸等其他氨基酸作為反應(yīng)底物時，實驗結(jié)果表明CML的形成量很低。但是作為形成CML的重要底物的賴氨酸，它對CML的形成具有決定性的作用，蛋白質(zhì)含有的賴氨酸殘基數(shù)量決定了CML的生成量。

周建弟等在研究中發(fā)現(xiàn)，氨基類化合物包括蛋白質(zhì)、肽類、胺、氨基酸等，在這些化合物中因含有還原性的氨基末端而易于和還原糖反應(yīng)，其中胺類的相關(guān)反應(yīng)速度是最快的；其次為氨基酸，在眾多氨基酸中，堿性氨基酸的反應(yīng)比其他氨基酸的都要快；蛋白質(zhì)由于其本身的氨基暴露的程度較小，它的反應(yīng)速率比肽類和氨基酸都要慢。孫佳賀等在對白湯醬油儲藏期間褐變與美拉德反應(yīng)的關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，醬醪發(fā)酵過程中氨基酸對醬醪色澤影響的強弱次序為酸性氨基酸>中性氨基酸>堿性氨基酸。

3.1.2 反應(yīng)底物中還原糖對CML的控制

大量的研究實驗證明，還原糖均可以與賴氨酸反應(yīng)生成CML。Ruttkat等[16]建立了4種不同的還原糖與賴氨酸生成CML的模擬反應(yīng)體系，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，4種還原糖的模擬反應(yīng)體系均能生成CML，而且在果糖、山梨糖、葡糖糖和半乳糖4種反應(yīng)體系中形成CML的數(shù)量依次升高。Li等[17]建立了3種糖與賴氨酸生成CML的模擬反應(yīng)體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在蔗糖、葡萄糖和乳糖這3種反應(yīng)體系中形成CML的量依次增大。但是 Sakai等[18]指出，果糖的糖基化能力比葡萄糖更強；Hinton等[19]的研究也表明，在葡萄糖-牛血清白蛋白體系中產(chǎn)生的CML含量要低于果糖-牛血清白蛋白體系。因此，是在果糖中生成的CML含量高還是在葡萄糖中生成的CML含量高，針對此研究結(jié)果目前還存在一些差異性，想要得到更確切的結(jié)果還需要進一步的研究。此外，Wu Qian等[20]研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境能夠加速非酶糖基化和葡萄糖自氧化產(chǎn)生CML，抑制消化道中碳水化合物水解酶(α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶)的活性來延遲葡萄糖的吸收，從而抑制CML的形成。

莊名揚[21]在研究中發(fā)現(xiàn)，釀酒原料小麥、高粱、玉米等中的淀粉、纖維素在各類淀粉水解酶、纖維素酶等的作用下，生成各類單糖，反應(yīng)速率為五碳糖>六碳糖，而六碳糖的反應(yīng)速率則為半乳糖>甘露糖>葡萄糖。孫佳賀等在研究中發(fā)現(xiàn)，六碳糖的美拉德反應(yīng)速度大概只有五碳糖的1/10。六碳糖相對于五碳糖來說碳鏈較長，所以碳架空間位阻效應(yīng)大，因此其反應(yīng)活性低，不利于反應(yīng)的進行?？偟膩碚f，還原糖的還原性越大，反應(yīng)活性越大，在同等條件下，越有利于CML的形成。所以，為了降低CML的含量，應(yīng)采用還原性較小的糖類作為反應(yīng)原料。

3.2 通過添加外源添加劑對CML的控制

研究表明，通過加入一些外源添加劑可以控制CML的形成。例如，檸檬酸是一種酸度調(diào)節(jié)劑，通常在食品的生產(chǎn)加工過程中，為了抑制CML的形成，可以通過添加適量的檸檬酸來調(diào)節(jié)食品體系的酸堿度。賴氨酸在堿性環(huán)境中會發(fā)生脫質(zhì)子化反應(yīng)形成具有更高反應(yīng)活性的自由基，利于CML的生成；相反，酸性環(huán)境中會抑制賴氨酸變成具有較強反應(yīng)活性的自由基，因此導(dǎo)致CML的形成受阻。

硼氫化鈉(NaBH4)是化學(xué)合成抗氧化劑中最常用的CML抑制劑，它之所以作為最常用的抑制劑是因為其具有很強的選擇性還原，它的分子結(jié)構(gòu)中有4個呈-1價的H原子，可以將酮類、醛類和酰氯類等羰基化合物中的羰基選擇還原成羥基。NaBH4能夠通過還原CML的中間產(chǎn)物乙二醛(GO)和果糖賴氨酸(FL)來抑制CML的形成。付全意[22]對葡萄糖-賴氨酸模擬反應(yīng)體系的研究發(fā)現(xiàn)，NaBH4不僅能夠還原CML的中間產(chǎn)物GO，而且還可以將形成CML的主要中間產(chǎn)物FL還原，終止其氧化裂解生成CML，從而抑制CML的形成。

部分天然抗氧化劑能夠有效抑制食品體系中CML的形成。付全意研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類物質(zhì)蘆丁對GO和FL生成CML以及葡萄糖向GO和FL的轉(zhuǎn)化均具有抑制作用。Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)，多酚類化合物可通過結(jié)合CML的中間產(chǎn)物GO及清除自由基的方式對葡萄糖-酪蛋白模擬反應(yīng)體系CML的形成發(fā)揮抑制作用。李曉明等[24]研究發(fā)現(xiàn)，蘆丁能夠有效抑制分別由活性二羰基化合物和還原糖引發(fā)的蛋白糖基化反應(yīng)。孫濤等[25]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素對晚期糖基化產(chǎn)物表現(xiàn)出顯著的抑制作用，且抑制作用強于氨基胍。Peng等[26]從肉桂皮中提取得到了表兒茶素和原花青素B2，通過實驗證明這2種物質(zhì)能夠有效抑制CML的生成，尤其是原花青素B2還可以通過捕獲CML形成過程中的中間產(chǎn)物GO從而阻斷CML的形成；在此之后，Peng等[27]又研究發(fā)現(xiàn)葡萄籽提取物富含的原花青素和兒茶素具有很強的抗氧化性，可以清除食品體系中CML生成的中間產(chǎn)物 GO。Wu Qian等[28]研究發(fā)現(xiàn)，蓮房原花青素(LSOPC)可以抑制美拉德反應(yīng)中CML的形成。Shen Yixiao等[29]在研究中發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以通過共軛反應(yīng)抑制甲基乙二醛(MGO)，從而進一步抑制糖化反應(yīng)；Wang Weixin等[30]研究發(fā)現(xiàn)，從山茶花中提取的植物化學(xué)物質(zhì)通過清除甲基乙二醛抑制了高級糖化最終產(chǎn)物的形成。因此，在發(fā)酵食品的實際生產(chǎn)過程中，經(jīng)常添加這些外源添加劑來控制CML的形成，從而保證產(chǎn)品的品質(zhì)。

3.3 通過控制加工工藝條件控制CML的形成

加熱溫度、加熱時間、水分含量等加工條件對CML的形成有很重要和直接的影響，例如相同的食物原料經(jīng)高溫、低濕加工產(chǎn)生的含量比低溫、高濕處理產(chǎn)生的CML含量高很多。因此，通過改善食品加工工藝條件可以更直接地達(dá)到對CML形成的抑制效果。實驗結(jié)果表明CML的含量雖然與加熱時間有一定的相關(guān)性，但是與加熱溫度之間是非線性關(guān)系，在堿性環(huán)境中更利于CML的生成，在高溫的加工條件下，會加劇CML的生成，因此，在實際生產(chǎn)過程中可以通過控制這些加工條件來控制發(fā)酵食品中CML的形成，主要的控制途徑有以下3個方面：一是降低食品加工溫度；二是縮短食品加工時間；三是減少食品加工步驟。

4 CML對人體產(chǎn)生的危害

CML在發(fā)酵食品中的危害主要體現(xiàn)在對人體健康的影響，其被人體攝入后，對人體會造成不可修復(fù)的慢性損傷。

從醫(yī)學(xué)界的研究中發(fā)現(xiàn)，AGEs可累積于人體不同的組織和器官中，當(dāng)AGEs的累積量達(dá)到或超過一定閾值時，會誘發(fā)糖尿病[31,32]、尿毒癥[33]、阿爾茲海默癥[34]等，而且會使這些病情加重。而CML作為AGEs的典型代表物，同樣可以累積于人體內(nèi)不同的組織和器官中，產(chǎn)生上述疾病，還有諸如腎衰竭(renal failure)、動脈粥樣硬化(atherosclerosis)[35]、慢性心力衰竭等。

這些研究表明控制發(fā)酵食品中CML的含量勢在必行，發(fā)酵食品是我國日常生活中不可或缺的食品，例如生活中常用的調(diào)味品老抽，其中的CML含量為游離態(tài)CML：(796.35±24.67) g/mL食品；結(jié)合態(tài)CML：(0.97±0.11) g/mL食品。這些發(fā)酵食品的攝入同時也造成我國居民對CML的攝入量增加，導(dǎo)致我國居民的健康水平下降，使人體慢性疾病的發(fā)病概率增大。

5 總結(jié)

發(fā)酵食品是我們?nèi)粘Ｉ钪斜夭豢缮俚氖称罚渲忻览路磻?yīng)所產(chǎn)生的AGEs是一直以來的熱門科研項目，CML作為AGEs的典型代表物更是被廣泛關(guān)注與研究。

經(jīng)過多年的研究，CML的形成機理、對人體的危害性、控制方法都已經(jīng)被逐步研究，而且檢測方法多種多樣，如ELISA法、GC-MS法和UPLC-MS法等，這些方法在操作復(fù)雜程度上、精度上、效率上都不盡相同，需要根據(jù)自己的需求來選取不同的檢測方法。

CML的形成機理較為復(fù)雜，CML的形成受到許多因素的綜合作用，比如熱加工處理方式、加熱時間、加熱溫度等。而通過研究發(fā)現(xiàn)，CML與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)，能促進多種疾病的發(fā)生。控制發(fā)酵食品中CML的含量可以從3個主要的方向進行：一是通過控制發(fā)酵食品中蛋白質(zhì)的含量即CML的底物含量；二是可以通過添加一些有效的外源添加劑；三是可以通過控制加工工藝條件來控制CML的形成。對于發(fā)酵食品中CML的控制，還存在許多有待研究的方面，因為CML在發(fā)酵食品中的形成過程是一個動態(tài)平衡過程，現(xiàn)在的研究模型較為簡單，要建立更加有效的抑制途徑需要一個完善的模型。