劉靜怡，彭銘燁，付彩霞，付彬，鐘曉凌，徐寧*

(1.湖北工業(yè)大學(xué) 湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心,武漢 430068；2.湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司，湖北 宜昌 443000)

醬油是世界上最古老的調(diào)味品之一，在中國已經(jīng)使用了2500多年，是亞洲最受歡迎的調(diào)味品之一，它是以大豆(豆粕)、小麥(面粉)為原料，經(jīng)米曲霉發(fā)酵制曲，在鹽水中進(jìn)行后發(fā)酵而成。隨著人們生活水平的提高，越來越多的人們在尋求更好的醬油風(fēng)味和營養(yǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，醬油除了具有調(diào)味作用外，還具有營養(yǎng)保健功效[1-4]。醬油中含有天然的抗氧化物質(zhì)，能顯著降低自由基對人體的傷害，其抗氧化能力是維生素C和維生素E的十幾倍。對醬油物質(zhì)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，其含有豐富的酚類物質(zhì)，而酚類物質(zhì)被公認(rèn)具有一定的抗氧化能力。

柑橘在我國有較廣的種植面積且產(chǎn)量巨大，是我國的主要水果之一。柑橘因富含維生素、礦物質(zhì)、酚類化合物等營養(yǎng)物質(zhì)而深受人們喜愛。目前，我國的柑橘加工業(yè)主要以柑橘果肉為主，大量的橘皮被直接丟棄，這不僅是資源的浪費(fèi)，更會對環(huán)境造成污染。對橘皮的研究發(fā)現(xiàn)，橘皮中也含有大量的酚類物質(zhì)，且其抗氧化能力與黃酮含量呈正相關(guān)。有研究人員發(fā)現(xiàn)橘皮精油有良好的抑菌作用，尤其是對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的生長抑制作用非常顯著，同時橘皮精油還有較強(qiáng)的自由基清除能力[5-13]。

本文以橘皮為輔料與傳統(tǒng)醬油制曲原料混合，用米曲霉(滬釀3.042)發(fā)酵制曲，研究橘皮的添加對醬油質(zhì)量指標(biāo)、抗氧化活性、亞硝酸鹽清除能力、酪氨酸酶抑制活性、黃酮含量、有機(jī)酸和風(fēng)味物質(zhì)的影響，以獲得具有特殊風(fēng)味的柑橘醬油。

1 材料與方法

1.1 原料

米曲霉(Aspergillusoryzae)AS 3.951(滬釀3.042)：湖北省食品發(fā)酵工程技術(shù)研究中心；豆粕、面粉、麩皮和橘皮：湖北土老憨調(diào)味食品股份有限公司。

1.2 儀器

UV-1601紫外/可見分光光度計 北京瑞利分析儀器有限公司；ZXJD-A430霉菌培養(yǎng)箱 上海智誠分析儀器制造有限公司； MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌器 松下健康醫(yī)療器械株式會社；UltiMate-3000高效液相色譜儀 美國Thermo公司；NL315SV-230冷凍干燥機(jī) 美國Avant公司。

1.3 試劑

蘆丁(99%)、有機(jī)酸(色譜純)、曲酸、L-多巴、酪氨酸酶：阿拉丁試劑(上海)有限公司；DPPH、ABTS：美國Sigma公司；其他化學(xué)試劑：均為化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 橘皮粉的制備

將新鮮的柑橘皮于-18 ℃下冷凍48 h，然后將柑橘皮置于冷凍干燥機(jī)托盤上，冷凍干燥24 h，最后將干燥后的柑橘皮進(jìn)行粉碎并通過120目的網(wǎng)篩，得到橘皮粉。

1.4.2 制曲工藝

曲料配方：實(shí)驗(yàn)組A(米+橘)，豆粕∶面粉∶橘皮粉∶麩皮為6∶2.5∶1∶0.5，對照組采用面粉替代橘皮粉；實(shí)驗(yàn)組B(米+橘后)，制曲階段與對照組相同，在對照組醬醪發(fā)酵的第1天加入曲料質(zhì)量10%的橘粉。豆粕經(jīng)浸泡后，115 ℃蒸壓20 min，冷卻后拌入面粉并接入種曲0.3%(W/W)，拌勻。制曲室34 ℃培養(yǎng)10～12 h，松曲1次。接著控溫32～35 ℃，19～22 h第2次松曲。最后調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度至28～30 ℃，保持該溫度至40 h制曲結(jié)束。

1.4.3 發(fā)酵工藝

將1.4.2中制得的成曲與其2倍重量的鹽水(18%NaCl)混合均勻，置于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵120天。

1.4.4 樣品的收集

在醬醪發(fā)酵的第120天收集發(fā)酵醪液，分析前所有樣品均于-20 ℃條件下儲存。

1.4.5 橘皮醬油指標(biāo)的測定

氨基酸態(tài)氮和總酸的測定參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.235-2016[14]；總氮的測定參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.5-2003[15]中凱氏定氮法測定醬油中總氮的含量；還原糖含量的測定采用DNS比色法[16]。

1.4.6 橘皮醬油抗氧化活性的測定

1.4.6.1 DPPH自由基清除能力的測定[17]

精密量取稀釋適當(dāng)倍數(shù)的醬醪液0.4 mL，加入0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液7.6 mL，充分震蕩搖勻，室溫避光黑暗條件下靜置30 min，然后使用紫外可見分光光度計測定517 nm處的吸光值，空白將用去離子水替換樣液。

1.4.6.2 ABTS自由基清除能力的測定[18]

將25 mL的7 mmol/L ABTS+·溶液與440 μL的140 mmol/L過硫酸鉀混合，置于暗處12～16 h，用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L，pH 7.4)將ABTS+·溶液稀釋至在波長734 nm處吸光度為0.70±0.02。將0.1 mL醬油稀釋樣品與4.9 mL ABTS+·溶液混合，搖勻后避光10 min后，在波長734 nm處測吸光度。

1.4.6.3 HRSA羥自由基清除能力的測定[19]

取9 mmol/L FeSO4溶液1.5 mL，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.5 mL和醬油稀釋樣品1.5 mL，混勻后，加入8.8 mmol/L H2O2溶液1.5 mL，搖勻，在37 ℃條件下水浴10 min，以蒸餾水代替水楊酸-乙醇溶液為樣品調(diào)零，于510 nm波長處測定吸光度，用蒸餾水做空白對照組，在510 nm波長處測定吸光度。

1.4.6.4 亞硝酸鹽清除能力

采用格里斯試劑比色法[20]。準(zhǔn)確吸取40 μL醬油稀釋樣品于10 mL比色管中，加入1 mmol/L NaNO220 μL，再加0.1 mol/L HCl 140 μL，搖勻，37 ℃水浴放置1 h，加入1 mL 3%乙酸，搖勻，再加80 μL的格里斯試劑，搖勻，避光反應(yīng)15 min，然后定容至刻度線，在520 nm處測定吸光值，同時做空白對照。

1.4.7 橘皮醬油酪氨酸酶抑制活性的測定

參照Wang等[21]的方法。

1.4.8 橘皮醬油多酚和黃酮含量的測定

參照Zheng等[22]的方法。

1.4.9 橘皮醬油有機(jī)酸的測定

有機(jī)酸的測定參照Park的研究方法[23]。

1.4.10 橘皮醬油風(fēng)味物質(zhì)的測定

醬油中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定參照劉晶晶的研究采用GC-MS法[24]。

1.4.11 數(shù)據(jù)處理方法

3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS及Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 橘皮醬油的理化指標(biāo)

在制曲或發(fā)酵中添加橘皮，對醬油的氨基酸態(tài)氮、總氮、總酸和還原糖的影響見表1。

表1 橘皮對醬油理化指標(biāo)的影響

氨基酸態(tài)氮、總氮、總酸和還原糖是醬油的主要質(zhì)量指標(biāo)，對醬油風(fēng)味的形成有著積極的作用。由表1可知，實(shí)驗(yàn)組A和B(橘皮添加時間不同)的氨基酸態(tài)氮和總氮無顯著差異，總酸和還原糖差異顯著。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組A、B的總酸含量分別提高了67.74%和37.63%，還原糖含量分別提高了20.36%和4.19%，氨基酸態(tài)氮含量分別降低了13.82%和17.07%，總氮含量分別降低了13.27%和14.22%。上述差異的原因可能是橘皮中含有大量的纖維素和果膠，經(jīng)過纖維素酶和果膠酶的作用，顯著提高了醬油中的酚酸物質(zhì)及還原糖含量。

2.2 橘皮醬油的抗氧化活性研究

圖1 橘皮對醬油抗氧化活性的影響

由圖1可知，橘皮對醬油抗氧化活性的影響。兩組實(shí)驗(yàn)組醬油的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和HRSA羥自由基清除能力均要強(qiáng)于對照組，分別增加了5.76%，1.40%，514.29%和434.57%，9.67%，3.44%。同時，制曲時添加橘皮(實(shí)驗(yàn)組A)對醬油的抗氧化活性提高幅度更大。

2.3 橘皮醬油的亞硝酸鹽清除活性和酪氨酸酶抑制活性研究

圖2 橘皮對醬油亞硝酸鹽清除活性和酪氨酸酶抑制活性的影響

由圖2可知，橘皮對醬油亞硝酸鹽清除能力和酪氨酸酶抑制活性的影響。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組A、B的亞硝酸鹽清除能力分別提高了66.75%和32.42%。同時，添加橘皮也使醬油的酪氨酸酶抑制活性增強(qiáng)，A、B兩組醬油的酪氨酸酶抑制率分別提高了381.92%和208.91%。比較兩組實(shí)驗(yàn)組，發(fā)現(xiàn)在制曲時添加橘皮對醬油的亞硝酸鹽清除能力和酪氨酸酶抑制活性的提高幅度更大。

2.4 橘皮醬油多酚和黃酮含量的測定

由圖3可知，3組醬油中黃酮和多酚的含量。通過比較3組醬油中的多酚和黃酮含量，可以發(fā)現(xiàn)橘皮的添加增加了醬油中黃酮和多酚的含量。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組A、B的多酚和黃酮含量分別提高了22.41%，134.32%和12.64%，84.62%。因此，添加橘皮能夠明顯提高醬油中多酚和黃酮的含量。

圖3 橘皮對醬油多酚和黃酮含量的影響

2.5 橘皮醬油有機(jī)酸分析

有機(jī)酸能夠影響醬油的酸味和甜味，從而對醬油的品質(zhì)產(chǎn)生影響。

表2 橘皮醬油有機(jī)酸含量

由表2可知，3組醬油中均未檢測出酒石酸，所含有機(jī)酸的種類相同，但在含量上有所不同。與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組A、B中乳酸含量分別提高了19.13%，12.64%；檸檬酸含量分別提高了17.66%，8.78%；乙酸分別提高了9.84%，3.46%。而3組醬油的琥珀酸和L-蘋果酸含量差別不大。

2.6 橘皮醬油風(fēng)味分析

3組醬油的揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量見表3。

表3 橘皮醬油揮發(fā)性物質(zhì)含量

續(xù) 表

由表3可知，添加橘皮能夠顯著增加醬油的風(fēng)味物質(zhì)，且橘皮添加的階段不同對醬油的風(fēng)味也有明顯的影響?？傮w上，實(shí)驗(yàn)組A、B的風(fēng)味物質(zhì)在種類和含量上顯著高于對照組，其醇類、酯類、醛類、酸類、酚類和烯烴類等主要揮發(fā)性成分在種類和含量上都發(fā)生了變化。特別是酸類、酚類、酯類和烯烴類物質(zhì)的含量有顯著提高。這可能是由于醬曲中含有的豐富的酶系導(dǎo)致醬醪發(fā)酵階段橘皮中揮發(fā)性活性成分不斷釋放到醬油中。

橘皮的添加顯著提高了醬油中醇類物質(zhì)的含量，尤其是苯乙醇在對照組(不加橘皮)醬油中未被檢測到，而在實(shí)驗(yàn)組A、B兩組醬油中均含有且含量較高，分別為180.26，141.03 ng/g。此外，橘皮的添加同時也提高了醬油中的乙醇含量，A、B兩組醬油乙醇含量與對照組相比分別提高了75.89%，54.98%。由于橘皮中含有大量揮發(fā)性酸味物質(zhì)，因此添加橘皮的醬油中乙酸含量明顯增加，同時顯著減少了2-氨基-6-甲基苯甲酸含量。對照組醬油中未被檢測到烯烴類物質(zhì)，而在實(shí)驗(yàn)組中均檢測到4種烯烴類物質(zhì)，分別為α-蒎烯、雙戊烯、香橙烯和D-檸烯，這是由于成熟水果的果皮中都含有一定量的烯烴類物質(zhì)。這些烯烴類物質(zhì)可賦予醬油柑橘香味，同時還能提高醬油的品質(zhì)。此外，橘皮的添加還使得實(shí)驗(yàn)組A、B兩組醬油中乙酸乙酯的含量較對照組分別提高了328.85%，245.66%，使醬油具有濃郁的酯香味。

根據(jù)表3的數(shù)據(jù)分析還可發(fā)現(xiàn)，橘皮添加階段(制曲或發(fā)酵)不同，其醬油中的揮發(fā)性物質(zhì)的含量也有所區(qū)別，如乙醇、乙酸和烯烴類物質(zhì)均是實(shí)驗(yàn)組A(制曲時添加橘皮)要高于實(shí)驗(yàn)組B(發(fā)酵時添加橘皮)。總的來說，在制曲階段添加橘皮更有助于醬油風(fēng)味的形成。

3 討論

本文主要研究了橘皮對醬油品質(zhì)的影響，并比較了在不同階段(制曲、發(fā)酵)添加橘皮所得到的醬油的各項指標(biāo)。通過對比橘皮添加對醬油的影響，分析了橘皮醬油的質(zhì)量指標(biāo)、抗氧化活性、有機(jī)酸、黃酮和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與傳統(tǒng)釀造醬油的差異。橘皮添加對醬油的氨基酸態(tài)氮和總氮無顯著影響，總酸和還原糖受橘皮添加時間影響比較顯著。與傳統(tǒng)醬油相比，橘皮醬油的總酸、還原糖含量分別提高了67.74%，20.36%。并且橘皮的添加能夠顯著增強(qiáng)醬油的抗氧化活性、亞硝酸鹽清除能力和酪氨酸酶抑制活性?？傮w上橘皮醬油中風(fēng)味物質(zhì)在種類和含量上顯著高于傳統(tǒng)醬油，其醇類、酯類、醛類、酸類、酚類和烯烴類等主要揮發(fā)性成分在種類和含量上都發(fā)生了變化。特別是酸類、酚類、酯類和烯烴類物質(zhì)的含量有顯著提高。這可能是由于醬曲中含有的豐富的酶系導(dǎo)致醬醪發(fā)酵階段橘皮中揮發(fā)性活性成分不斷釋放到醬油中。對比橘皮添加階段的不同，可以發(fā)現(xiàn)：在制曲階段添加橘皮更能顯著提高醬油的品質(zhì)，增強(qiáng)醬油的抗氧化活性以及更有助于醬油風(fēng)味的形成。