周興鵬，張敬鋮，樊龍星，趙華

(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457)

陳皮為蕓香科柑橘屬植物橘及其栽培變種的成熟果皮，果皮以陳者良，故名陳皮[1]。是我國傳統(tǒng)中草藥之一，味辛、微苦、性溫、歸肺、脾經(jīng)，具有行氣健脾、和胃止嘔和燥濕化痰等功效[2]。研究表明，陳皮中含有多種活性成分，主要有黃酮類化合物、揮發(fā)油、多糖、生物堿和多種人體必需的微量元素等[3]。陳皮中的黃酮類化合物主要有新橙皮苷、橙皮苷、桔皮素和川陳皮素等，可以抗過敏、抗氧化、預(yù)防腫瘤發(fā)生和動脈粥樣硬化等[4]。蔣林等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，陳皮中的黃酮類化合物可以改善脂質(zhì)代謝異常，且具有糖耐受的作用[5]。陳皮水煎液體外實(shí)驗(yàn)表明，陳皮能增強(qiáng)人唾液淀粉酶的活性,有一定健脾胃的作用[6]。陳皮的醇提物可對抗組織胺所導(dǎo)致的豚鼠離體氣管痙攣性收縮[7]。除此之外，陳皮既是傳統(tǒng)的調(diào)味佳品，也有很高的藥用價值，藥食同源，在國內(nèi)外有很高的認(rèn)可度[8]。

以陳皮為原料，采用超聲提取工藝制備陳皮浸提液，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對浸提條件進(jìn)行優(yōu)化，并測定了最優(yōu)條件下生產(chǎn)的陳皮浸提液的揮發(fā)性成分。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳皮：市售新會陳皮；95%食用酒精：天津市寧河縣酒廠；亞硝酸鈉、硝酸鋁(均為分析純)：天津市化學(xué)試劑一廠；無水乙醇(分析純)：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蘆丁、二氯甲烷(均為分析純)：阿拉丁試劑有限公司；無水硫酸鈉、無水碳酸鈉(均為分析純)：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KH-500E型超聲波清洗器 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；高速中藥粉碎機(jī) 天津華鑫儀器廠；DH-101型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司；SH2-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 河南省予華儀器有限公司；UV-5200型紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司；7890A/5975C型GC-MS聯(lián)用儀 美國Agilent公司。

1.3 陳皮浸提液的制備流程及操作要點(diǎn)

陳皮→烘干→粉碎→浸提→抽濾→成品。

將陳皮置于50 ℃干燥箱中烘干，烘干后粉碎過40目篩，過大的未粉碎顆?？芍貜?fù)此操作，直至原料全部粉碎完全為止。取粉碎后的陳皮于250 mL的燒杯中，分別按一定比例加入食用酒精。在超聲裝置中加入約一半的水，將燒杯放入其中，設(shè)置超聲裝置功率為30 Hz進(jìn)行浸提，提取結(jié)束后，將溶液分離，得到浸提原液。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 陳皮浸提液黃酮含量的測定方法

配制不同濃度的蘆丁對照品溶液，參照文獻(xiàn)[9]，采用硝酸鋁顯色法測定。以不加蘆丁的溶液為空白對照，在波長510 nm下測定吸光度值A(chǔ)。以蘆丁含量C為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：A=0.4051C+0.0062，相關(guān)系數(shù)R2=0.9977。

根據(jù)不同條件下測定的吸光度，按回歸方程計(jì)算出待測液的質(zhì)量濃度，按下式計(jì)算總黃酮提取率：

式中：Y為陳皮浸提液中的黃酮得率，%；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線上對應(yīng)的蘆丁含量，mg；V為所制備的陳皮浸提液的體積，mL；W為陳皮粉末的質(zhì)量，mg。

1.4.2 陳皮浸提液的揮發(fā)性成分分析

測定方法：浸提液的揮發(fā)性成分采用GC/MS法進(jìn)行分析檢測[10-13]。浸提液揮發(fā)性成分的提取方法參照文獻(xiàn)[14]。

2 結(jié)果與討論

2.1 浸提條件對黃酮提取率和口感的影響

黃酮類化合物是陳皮的主要化學(xué)成分[15]，故以黃酮提取率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)研究，來獲得最佳的陳皮浸提液。

2.1.1 料液比對黃酮提取率的影響

稱取一定量的陳皮，按料液比1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35分別加入50%(V/V)的食用酒精溶液，超聲提取40 min?？疾炝弦罕葘S酮提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 料液比對黃酮提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比的增加，黃酮提取率和口感評分都迅速增加。當(dāng)料液比為1∶25時，黃酮提取率達(dá)到最高，繼續(xù)增加料液比，提取率變化不明顯。當(dāng)料液比為1∶30時，口感評分最好，繼續(xù)增加料液比，口感評價反而降低。因此，綜合提取率和口感評分2個指標(biāo)，得到陳皮浸提液的最佳料液比為1∶30。

2.1.2 酒精濃度對黃酮提取率的影響

稱取一定量的陳皮，按料液比1∶30分別加入40%，50%，60%，70%，80%(V/V)的食用酒精溶液，超聲提取40 min?？疾炀凭珴舛葘S酮提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 酒精濃度對黃酮提取率的影響

由圖2可知，黃酮提取率和口感評分隨著酒精濃度的升高而升高，當(dāng)酒精濃度為70%(V/V)時，黃酮提取率和口感評分均達(dá)到最高。繼續(xù)提高酒精濃度，黃酮提取率和口感評分不再增加。因此，得到陳皮浸提液的最佳酒精濃度為70%(V/V)。

2.1.3 超聲時間對黃酮提取率的影響

稱取一定量的陳皮，按料液比1∶30分別加入70%(V/V)的食用酒精溶液，超聲提取30，40，50，60，70，80 min?？疾斐晻r間對黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 超聲時間對黃酮提取率的影響

由圖3可知，隨著超聲時間的延長，黃酮提取率逐漸升高，但增加不明顯，50 min后黃酮提取率將不再增加。陳皮浸提液口感在50～60 min時最佳。綜合考慮，得到陳皮浸提液的最佳超聲時間為50 min。

2.2 運(yùn)用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化陳皮的浸提條件

采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定顯著因素的最優(yōu)水平，由單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，選擇以料液比、酒精濃度、超聲時間為因素設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表2 回歸模型顯著性與方差分析

續(xù) 表

根據(jù)表1數(shù)據(jù)，以口感評分Y為效應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得口感評分(Y)與各因素的回歸方程如下：

Y=90.8+5.25A-0.12B+5.13C+0.5AB+0.5AC-1.75BC-7.03A2-5.28B2-4.77C2。

由擬合方程可知，方程自變量平方項(xiàng)的符號皆為負(fù)值，及拋物線的開口向下，因此存在對應(yīng)的極大值點(diǎn)。由方差分析(見表2)可知，模型極顯著(P=0.0014<0.001)，失擬誤差的P值是0.1206>0.05，表明相對于純誤差失擬是不顯著的，表明回歸方程模型的顯著性及可靠性良好，不同處理間的差異很顯著。擬合模型的R2=0.9427，表明94.27%的變異來源于自變量。預(yù)測模型R2=0.8690，表明試驗(yàn)值與對應(yīng)的模型預(yù)測值之間高度一致，即回歸模型具有高度的相關(guān)性，由此可知模型擬合良好，可用該回歸模型代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對口感的評分結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測。

分析表2可知，各因素對口感評分均有影響。其中一次項(xiàng)中，對口感評分影響顯著的是A(料液比)、C(超聲時間)，而B(酒精濃度)的影響則不顯著。二次項(xiàng)中A2、B2、C2對口感評分影響均顯著。交互項(xiàng)中，AB、AC、BC之間的交互作用不顯著。

聯(lián)合響應(yīng)面回歸分析和回歸方程繪制的響應(yīng)面圖形和等高線分析圖見圖4～圖6。從響應(yīng)面的最高點(diǎn)和等高點(diǎn)可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在最大值。隨著每個因素的增大，響應(yīng)值增大；當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小，即響應(yīng)面的最高點(diǎn)同是底面上等值最小橢圓的中心點(diǎn)。

圖4 超聲時間與酒精濃度交互作用影響口感評分的預(yù)測響應(yīng)面圖

圖5 超聲時間與料液比交互作用影響口感評分的預(yù)測響應(yīng)面圖

圖6 酒精濃度與料液比交互作用影響口感評分的預(yù)測響應(yīng)面圖

在料液比為1∶30時，超聲時間與酒精濃度之間的交互作用對口感評分的影響見圖4，3D曲線較為平滑，等高線趨于圓形，說明交互作用不顯著。在酒精濃度為70%時，超聲時間與料液比之間的交互作用對口感評分的影響見圖5，3D曲線較為平滑，等高線趨于圓形，說明交互作用不顯著。在超聲時間為50 min時，酒精濃度與料液比之間的交互作用對口感評分的影響見圖6，3D曲線較為平滑，等高線趨于圓形，說明交互作用不顯著。

通過Design-Expert 8.0軟件分析，最佳提取條件為料液比1∶31.74，酒精濃度69%(V/V)，超聲時間56.89 min，此時理論預(yù)測值口感評分為93.22?？紤]實(shí)際操作實(shí)驗(yàn)條件，確定料液比、酒精濃度和超聲時間分別為：1∶32，69%(V/V)，57 min。重復(fù)3次試驗(yàn)，平均口感得分為93，與預(yù)測值為93.22基本一致，說明回歸方程與實(shí)際情況擬合很好，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性。

2.3 陳皮浸提液的揮發(fā)性成分分析

陳皮浸提液揮發(fā)性成分總離子流圖見圖7。

用NIST標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索并與標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行比對，檢出化合物成分共56種，包括酯類(9種)、醇類(5種)、酸類(5種)、烯類(14種)、烷類(12種)、醛酮類(5種)，其他物質(zhì)(6種)，揮發(fā)性成分種類較多。含量最多的組成成分是D-檸檬烯(59.81%)，是陳皮浸提液的典型揮發(fā)性成分；含量較高的還有亞油酸(5.72%)、亞油酸甲酯(4.49%)、亞麻酸甲酯(4.27%)、棕櫚酸(2.87%)、棕櫚酸甲酯(2.34%)、巴倫西亞橘烯(1.62%)、磷酸三丁酯(1.13%)、正十四烷(0.96%)、正十五烷(0.95%)、芳樟醇(0.93%)等。

圖7 陳皮浸提液GC-MS分析總離子流色譜圖

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)證明，用超聲提取法對陳皮進(jìn)行浸提是可行的。在提取條件為料液比1∶32、酒精濃度69%(V/V)、提取時間57 min時，可獲得最佳的黃酮提取率。該工藝操作簡單，成本低廉。生產(chǎn)的陳皮浸提液經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析，共鑒定出56種揮發(fā)性成分，組成種類較多，其中D-檸檬烯是主要的揮發(fā)性成分。D-檸檬烯在香料產(chǎn)業(yè)中可直接用于調(diào)香[16]，黃酮類化合物在食品加工行業(yè)可作為天然色素使用[17]。本實(shí)驗(yàn)可為提取中草藥得到食品添加劑提供參考。