崔唱 高夏歡 王曉娜 章克 陳騰祥

【摘要】目的 觀察二甲基亞砜（DMSO）對TOV-112D整合素β4（Integrin β4）的表達。進一步為DMEM是否具有降低腫瘤細胞粘連的作用，提供理論依據。方法 采用卵巢癌細胞TOV-112D為實驗對象，降低其設置為空白對照組與實驗組。蛋白免疫印跡法（Western blot）分別檢測空白對照組及實驗組細胞中Integrin β4的表達水平。結果 Western blot 檢測顯示，空白對照組的細胞具有較高的Integrin β4表達;與空白對照組比較，在加入DMSO的實驗組中，Integrin β4表達明顯下調，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 DMSO使細胞Integrin β4的表達下調，抑制了卵巢癌細胞的粘附，對卵巢癌的遷移增生有促進作用。

【關鍵詞】二甲基亞砜;整合素β4;遷移;預后

【中圖分類號】R329.8 【文獻標識碼】A 【文章編號】ISSN.2095.6681.2019.27..02

整合素β4的主要功能是維持上皮細胞的完整性，調節(jié)半橋粒的的形成;半橋粒是基底細胞表面的粘附結構[1-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，整合素β4在上皮性卵巢癌細胞中的表達也有增高，隨著惡性程度的增高，其表達也增高。整合素β4在多種腫瘤中均有較高的表達，與腫瘤細胞的惡性程度相關，可以作為腫瘤的早期靶點候選標志物[5]。在本研究中，將相同病理類型的上皮性卵巢癌細胞，進行培養(yǎng)后提取蛋白進行蛋白電泳檢測隨著上皮性卵巢癌細胞整合素β4表達程度，探討DMSO對腫瘤細胞的惡性質及黏附性有什么影響。

1 實驗方法

1.1 TOV-112D細胞的常規(guī)培養(yǎng)

人卵巢癌細胞系TOV-112D細胞為貼壁生長的細胞，用1640培養(yǎng)基+10%胎牛血清（FBS），置于37℃，5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達到70%左右，即可進行后續(xù)實驗的處理。

1.2 細胞蛋白的提取

吸盡 PBS，每皿（6 cm 皿）加入80 uL預冷的細胞裂解液（RIPA），搖晃培養(yǎng)皿使其充分覆蓋細胞，于冰上勻速搖晃裂解約10 min。RIPA中加入蛋白酶抑制劑（PMSF）（RIPA：PMSF=100：1）。

將細胞碎片和裂解液移至1.5 mL離心管中。在高速冷凍離心機中4℃，12000 r/min，離心20 min;離心，上清轉移到0.5 mL的離心管中，放于-80℃保存。

1.3 蛋白含量的測定（BCA 蛋白濃度測定試劑盒）

按50倍體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B（50：1）配制適量BCA工作液，充分混勻。BCA工作液室溫24 h 內穩(wěn)定（A：3750 μL，B：75 μL）。完全溶解蛋白標準品，取10 μL稀釋至100 μL，終濃度為0.5 mg/mL。

用RIPA裂解液90 μL+10 μL標準品，將標準品按0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板的標準品孔中，加用于稀釋標準品的溶液（RIPA 強）補足到20 μL。加適當體積樣品到96孔板的樣品孔中，加用于稀釋標準品的溶液至20 μL（1 μL樣品+19 μL RIPA強）。各孔加入200 μL BCA工作液，用恒溫培養(yǎng)振蕩器37℃，80r放置30 min。

1.4 SDS-PAGE 電泳和蛋白質印跡（Western blot）分析

1.4.1 SDS-PAGE 電泳

待到積層膠凝固后，組裝電泳設備并處理樣品：將蛋白樣品定量后，用上樣緩沖液按照上樣量稀釋樣品（蛋白量：30～60 ?g），將制好的樣品100℃加熱變性5 min，瞬時離心，備用。用20 ?L加樣槍貼壁按預定的順序加樣，制樣量為20 μL/孔。未上樣的上樣孔加入等量的1×樣品緩沖液對照。積層膠電泳電壓為80 V，分離膠電泳電壓為120 V。電泳總時間2 h左右當指示劑溴酚藍電泳至底部時，終止電泳。

1.4.2 蛋白質印跡曝光

選擇PVDF膜親水性好的一面貼膠。通電轉膜，電流要求恒流300 mA，轉膜時間為1 h左右。輕輕用眼科鑷取出PVDF膜，將膜放在TBST中，在室溫下?lián)u床上勻速清洗3次，每次5 min。

在室溫下孵育2～3 h或者于4℃冰箱中過夜孵育一抗后，在搖床上用TBST將PVDF膜清洗3次，5 min/次;將同一張PVDF膜于室溫下孵育二抗，孵育1 h（當二抗與一抗接合后可以根據二抗所攜帶的標記而顯示出一抗的位置）;搖床上用TBST將膜清洗3 次，5 min/次。通過曝光儀，將PVDF膜上的蛋白進行掃描顯影后獲取其圖像并統(tǒng)計分析。

2 結 果

經Western blot檢測（圖1），各泳道在205 kDa處各有一條條帶，即整合素β4。隨著細胞培養(yǎng)密度的增加，整合素β4的條帶灰度值明顯降低。與1泳道相比，整合素β4在2泳道的灰度值降低，有顯著性差異，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），表明DMSO可使細胞整合素β4的表達降低，抑制細胞的黏附，增加細胞遷移的可能性。

3 結 論

有研究表明DMSO 具有細胞毒性。本實驗通過DMSO對卵巢癌細胞的研究，進一步證明了DMSO可以通過誘導整合素β4下調，進而抑制腫瘤細胞的遷移擴增，增加腫瘤的惡病質。

參考文獻

[1] DiPersio，C.M.R.van der Neut，et al.A.Kreidberg，A.Sonnenberg，and R.O.Hynes.a3β1 and a6β4 integrin receptors for laminin-5 are not essential for epidermal morphogenesis and homeostasis during skin development.J.Cell Sci.2000，113：3051-3062.

[2] Gambaletta，D.A.Marchetti，et al.Mercurio，A.Sacchi，and R.Falcioni.Cooperative signaling betwwen a6β4 integrin and ErbB-2 receptor is required to promote phosphatidylinositol 3-kinase-dependent invasion.J.Biol.Chem.2000，275：10604-10610.

[3] Bachelder，R.E.M.J.Ribick，et al.P53 inhibits a6β4 integrin survival signaling by promoting the caspase 3-dependent cleavage of AKT/PKB.J.Cell Biol.1999，147：1063-1072.

[4] Dans，M.L.Gagnoux-Palacios，et al.Tyrosine phosphorylation of the β4 integrin cytoplasmic domain mediates Shc signaling to extracellular signal-regulated kinase and antagonizes formation of hemidesmosomes.J.Biol.Chem.2001，276：1494-1502.

[5] Mercurio AM，Rabinovitz I.Towards a mechanistic understanding of tumor invasion-lessons form the alpha6 beta4 integrin[J].Sem Cancer Biol，2001（2）：129-141.

本文編輯：趙小龍