李文翠，高波，張吉才

甲狀腺乳頭狀癌是常見的甲狀腺惡性腫瘤，約占甲狀腺癌的3/5～4/5[1]。與其他惡性腫瘤相比，大部分甲狀腺乳頭狀癌的病人的手術(shù)治療效果和遠(yuǎn)期預(yù)后較好，但仍然有部分病人存在腫瘤局部侵襲和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這部分病人的治療效果及預(yù)后都較差[2]，因此尋找甲狀腺乳頭狀癌的高危復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的因素與檢驗(yàn)標(biāo)志物尤為重要，有研究[3-4]提示G-蛋白偶聯(lián)受體5(LGR-5)和組織蛋白酶D(Cath D)在肝臟、胃腸道、呼吸等系統(tǒng)的惡性腫瘤中均有過表達(dá)，并且與疾病的發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)，但對二者在甲狀腺腫瘤中的表達(dá)研究較少。筆者檢測了LGR5和Cath D在甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁組織中表達(dá)情況，探討它們的表達(dá)與腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料納入2014年1月至2017年3月湖北省十堰市太和醫(yī)院首診甲狀腺癌病人，通過手術(shù)切除癌組織病理活檢提示為原發(fā)性甲狀腺乳頭狀癌病人67例，其中男性15例，女性52例；大于45歲38例，小于或等于45歲29例；腫瘤直徑大于2 cm 34例，小于或等于2 cm 33例；腫瘤有局部侵犯包膜32例，有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例。所有病人均依據(jù)2016年美國甲狀腺學(xué)會(huì)制定的甲狀腺癌的TNM標(biāo)準(zhǔn)[1]進(jìn)行臨床和病理分期，Ⅲ+Ⅳ期29例，Ⅰ+Ⅱ期38例。對照組選取相同腫瘤病人距離癌邊緣大于2 cm的正常甲狀腺組織，光學(xué)顯微鏡下確診無癌細(xì)胞。所有病人都簽署了知情同意書，本研究通過了湖北省十堰市太和醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(G20130278)。

1.2方法

1.2.1試驗(yàn)方法 選擇LGR5試劑盒(武漢博士德)，Cath D試劑盒(武漢博士德)，采用免疫組化法檢測兩組病人甲狀腺組織中LGR5、Cath D的表達(dá)。一抗兔抗人Cath D多克隆抗體、兔抗人LGR5多克隆抗體稀釋成1∶400，放置于4 ℃的冰箱中備用。通過切片-脫蠟-水化-浸泡-阻斷過氧化物酶-一抗-二抗-顯色-復(fù)染-脫水-封片等步驟，最后在切片上滴加適量中性樹脂膠，封片，晾干。

1.2.2結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) LGR5陽性表達(dá)位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，Cath D陽性表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，呈均勻一致的棕色顆粒。在切片中選取5個(gè)高倍視野(400倍)，計(jì)數(shù) 200個(gè)細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞占全部腫瘤細(xì)胞的百分比，陽性細(xì)胞百分比<10%為陰性，≥10%為陽性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法通過SPSS 16.6軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料用例數(shù)及率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1甲狀腺乳頭狀癌和癌旁正常甲狀腺組織中LGR5及CathD的表達(dá)甲狀腺乳頭狀癌和癌旁正常甲狀腺組織中LGR5的陽性表達(dá)率分別為62.69%(42/67)、2.99%(2/67)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Cath D的陽性表達(dá)率分別為70.15%(47/67)、4.48%(3/67)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。LGR5、Cath D在甲狀腺乳頭狀癌和癌旁甲狀腺組織中的免疫組化染色結(jié)果見圖1，2。

2.2甲狀腺乳頭狀癌組織中LGR5和CathD表達(dá)與不同臨床病理因素的關(guān)系在甲狀腺乳頭狀癌組織中，LGR5和Cath D在較大的腫瘤直徑，腫瘤局部外侵，頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以及較晚的TNM分期中表達(dá)的陽性率較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中部分表達(dá)與病人年齡與性別無關(guān)(P>0.05)，見表2。

表1 LGR5及Cath D在甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁組織的表達(dá)/例(%)

表2 甲狀腺乳頭狀癌中LGR5和Cath D在不同臨床病理因素中的表達(dá)

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌總體預(yù)后良好，但仍有10%～30%的病人出現(xiàn)早期復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。甲狀腺乳頭狀癌預(yù)后不良的主要臨床病理因素主要包括腫瘤組織的局部侵襲和頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[5-6]。LGR5 作為Wnt信號通路的靶基因和腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，屬于跨膜蛋白激酶受體，有研究表面LGR5陽性的細(xì)胞具有分化成為所有的上皮細(xì)胞的潛能，其參入腫瘤細(xì)胞由幼稚到成熟的過程，對腫瘤內(nèi)在起到調(diào)控的作用，與多種腫瘤的生物學(xué)進(jìn)展密切相關(guān)，還是特異性較高的腫瘤標(biāo)志物[7]；Cath D是一種蛋白水解酶，其能分解基膜和間質(zhì)I、Ⅲ型膠原蛋白、肌動(dòng)蛋白及纖維連接蛋白等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤，其活化后可以溶解并催化基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，使局部形成溶解的區(qū)域，此時(shí)細(xì)胞間通路打開，對腫瘤的惡變和轉(zhuǎn)移有明顯促進(jìn)作用，參入腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移，對細(xì)胞代謝產(chǎn)物加工、細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)代謝、細(xì)胞凋亡過程起到重要作用[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺乳頭狀癌組織中LGR5和Cath D陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常甲狀腺組織，其機(jī)制可能與Wnt/β-catenin信號通路失調(diào)有關(guān)，該信號通路可促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的增殖、甲狀腺結(jié)構(gòu)破壞、加速腫瘤分化、加快頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和血管浸潤[9-10]。這與我國盧秀波等[11]的研究結(jié)果一致，其運(yùn)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)及免疫組化SP法檢測40例甲狀腺癌病人組織蛋白酶B(Cath-B)的陽性表達(dá)率高達(dá)82.5%。國外專家早有研究[12]顯示甲狀腺癌惡性腫瘤的平均Cath D活性與甲狀腺冷良性結(jié)節(jié)(P<0.001)和Graves病組織(P<0.05)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步論證了甲狀腺癌中Cath D的過表達(dá)增加了cath D在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中的潛在作用。國內(nèi)還有研究[13]表明Cath D在乳腺癌組織陽性表達(dá)率明顯高于正常乳腺組織，Cath D的表達(dá)與乳腺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤體積、雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)表達(dá)密切相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了Cath D與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者LGR5和Cath D陽性表達(dá)率(94.59%與89.19%)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(46.67%與50.00%)，有局部包膜侵犯的腫瘤組織中LGR5和Cath D陽性表達(dá)率(87.50%與90.62%)明顯高于無局部包膜侵犯的組織，可能是LGR5及Cath D通過旁分泌機(jī)制，促進(jìn)間質(zhì)成纖維細(xì)胞外向性生長、刺激腫瘤新生血管的形成[14]、加速腫瘤細(xì)胞的局部浸潤與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑越大，TNM分期越高，LGR5及Cath D的陽性表達(dá)率越高，與腫瘤的惡性程度和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)。

綜上所述，甲狀腺乳頭狀癌組織中LGR5和Cath D的高表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過檢測它們的表達(dá)，對甲狀腺乳頭狀癌的生物學(xué)行為可能具有一定的臨床意義。

(本文圖1，2見插圖1-1)