方 際，吳鶴瑾，王 浩

足細(xì)胞在蛋白尿的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]，但因其為高度分化的終末期細(xì)胞，其體外培養(yǎng)一直較為困難。國(guó)外已有實(shí)驗(yàn)室成功建立人、鼠條件永生化足細(xì)胞株[2,3]，但細(xì)胞株在生長(zhǎng)、遺傳特征及細(xì)胞結(jié)構(gòu)等方面與原代細(xì)胞相差較大，不能很好地模擬相關(guān)的腎臟病理生理學(xué)狀況，這使基于永生化足細(xì)胞株的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度大大降低。以前的文獻(xiàn)主要集中在大鼠的原代足細(xì)胞培養(yǎng)，有關(guān)小鼠足細(xì)胞原代培養(yǎng)技術(shù)少見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)比較差異過(guò)篩法和免疫磁珠法，旨在明確小鼠腎臟足細(xì)胞原代培養(yǎng)的最佳模式。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 C57/BL6J小鼠，30 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自Leica SP8公司，相差顯微鏡購(gòu)自O(shè)LYMPUS公司，免疫磁珠購(gòu)自Dynal公司，PCR 儀購(gòu)自ABI公司。RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自Cornning公司，Ⅳ型膠原酶、鏈酶蛋白酶E、脫氧核糖核酸酶Ⅰ均購(gòu)自Sigma公司，胎牛血清購(gòu)自Gibco公司，Podocin抗體購(gòu)自Abcam公司，熒光二抗購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，曲拉通 X-100及80、150、300目不銹鋼篩網(wǎng)購(gòu)自上海生工技術(shù)有限公司。

1.2 C57/BL6J小鼠腎小球分離

1.2.1 差異過(guò)篩法 小鼠腹腔注射2.5% 戊巴比妥(0.1 ml/30 g)，麻醉后，用75% 乙醇消毒皮膚，先后暴露腹腔、胸腔，行心臟灌注后迅速取出雙側(cè)腎臟，置于4 ℃ D-Hank’s 溶液中。去除包膜，分離腎皮質(zhì)，用眼科剪將皮質(zhì)剪成碎泥狀。用注射器針芯輕輕研磨腎皮質(zhì)，并不斷用D-Hank’s 溶液沖洗。該沖洗液先過(guò)80 目不銹鋼篩網(wǎng)，濾過(guò)的溶液再過(guò)150 目的不銹鋼篩網(wǎng)，最后過(guò)300 目篩網(wǎng)。滯留在300 目篩網(wǎng)上即為腎小球初分離物，反復(fù)沖洗篩網(wǎng)后，收集分離物制成懸液，靜置10 min 后，1000 r/min離心5 min，棄除上清，收集純化的腎小球沉淀，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成腎小球懸液。

1.2.2 免疫磁珠法 常規(guī)動(dòng)物麻醉、消毒皮膚，采用Liu等[4]方法從胸主動(dòng)脈灌注，在腎臟建立局部循環(huán)。從胸主動(dòng)脈先用37 ℃預(yù)熱的PBS灌注10 ml(5 ml/min)，然后灌注37 ℃預(yù)熱的總體積4 ml，包含有(膠原酶10 mg/ml+鏈酶蛋白酶E 10 mg/ml+脫氧核糖核酸Ⅰ 100 U/μl+免疫磁珠 200 μl)液體，灌注結(jié)束后迅速取出動(dòng)物雙側(cè)腎臟，置于4 ℃ D-Hank’s 溶液中。去除包膜，分離腎皮質(zhì)，用眼科剪將皮質(zhì)剪成碎泥狀。移入2 ml離心管，再加入上述消化酶1 ml，震蕩孵育37 ℃，300 r/min，5 min。用移液槍輕柔吹打數(shù)次，過(guò)150目金屬篩1次，借助磁力架洗滌、重懸，轉(zhuǎn)入離心管中1000 r/min 離心5 min，棄上清，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液制成腎小球懸液。

1.3 腎小球形態(tài)學(xué)觀察和計(jì)數(shù) 用10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮腎小球，倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)。經(jīng)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)不同分離方法得到的每只C57/BL6J小鼠的腎小球數(shù)目，同時(shí)計(jì)算無(wú)鮑曼囊腎小球占總腎小球的百分比，即為腎小球純度。以2×104/孔的密度接種于六孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 免疫熒光鑒定 傳代培養(yǎng)7 d，待細(xì)胞分化鋪滿瓶底后再行免疫熒光染色。步驟：足細(xì)胞以適當(dāng)密度種植于24孔板上，37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞密度為60%～75%。4%多聚甲醛固定15 min，0.5%曲拉通 X-100穿孔15 min，1%牛血清白蛋白封閉30 min，分別加一抗Podocin(1∶1000)4 ℃過(guò)夜，然后加1∶500稀釋的二抗室溫反應(yīng)1 h，然后加DAPI(1∶1000)3 min，上述每步操作后均用PBS漂洗。熒光顯微鏡下觀察。

1.5 PCR法鑒定足細(xì)胞的標(biāo)志蛋白 以永生化小鼠足細(xì)胞為陽(yáng)性對(duì)照，小鼠肝細(xì)胞系為陰性對(duì)照。用Trizol 試劑提取足細(xì)胞總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將產(chǎn)物進(jìn)行PCR檢測(cè)，反應(yīng)體系參照試劑盒說(shuō)明書(shū)，反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，每樣品做3個(gè)復(fù)管。

引物和內(nèi)參序列如下：Podocin-F,5′-CACTCTTCAGTCGCTGTCCA-3′；Podocin-R, 5′-AGTTGATGCTCCCTTGTGCT-3′。GAPDH-F 5′-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3′；GAPDH-R, 5′-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3′。

2 結(jié) 果

2.1 腎小球的分離結(jié)果 差異過(guò)篩法獲得腎小球純度達(dá)(90.2±1.6)%，1只C57/BL6J小鼠可以得到(10 421±2421)個(gè)腎小球；視野中腎小球結(jié)構(gòu)完整，可見(jiàn)腎小管碎片。免疫磁珠法獲得的腎小球純度達(dá)(96.7±1.2)%，1只C57/BL6J小鼠可以得到(16 112±2651)個(gè)腎小球；視野中腎小球結(jié)構(gòu)完整，基本無(wú)腎小管。免疫磁珠法獲得腎小球純度和數(shù)目均高于差異過(guò)篩法，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 腎小球的培養(yǎng)及足細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征 腎小球接種第3天可見(jiàn)80%以上腎小球貼壁，少量腎小球周?chē)卸噙呅渭?xì)胞爬出(圖1A)，第7～10天所有貼壁腎小球周?chē)加写罅考?xì)胞爬出(圖1B)。消化傳代后的足細(xì)胞繼續(xù)生長(zhǎng)，為多邊形，無(wú)突起伸出，細(xì)胞迅速生長(zhǎng)至融合狀態(tài)，呈鋪路石樣外觀(圖1C)。第14天可呈完全分化狀態(tài)，細(xì)胞體和細(xì)胞核較增殖狀態(tài)顯著增大，自細(xì)胞體伸出明顯的樹(shù)枝樣突起，常見(jiàn)雙核，相鄰細(xì)胞間形成連接(圖1D)。

圖1 腎小球培養(yǎng)的原代足細(xì)胞

A.培養(yǎng)第3天(×200)；B.培養(yǎng)第7天(×200)；C.培養(yǎng)第14天(×100)；D.培養(yǎng)第14天(×400)

2.3 腎小球足細(xì)胞鑒定

2.3.1 免疫熒光染色鑒定 原代培養(yǎng)的足細(xì)胞均有Podocin蛋白染色，熒光閃亮，呈明顯的亮綠色，在細(xì)胞漿內(nèi)以絲狀或線性沿細(xì)胞骨架分布，分布均勻，熒光染色細(xì)胞比例均為100%，證實(shí)了培養(yǎng)的細(xì)胞確為足細(xì)胞(圖2)。

圖2 原代足細(xì)胞Podocin蛋白免疫熒光染色(×200)

A.原代足細(xì)胞核DAPI染色；B.原代足細(xì)胞漿Podocin染色；C.原代足細(xì)胞merge圖片

2.3.2 PCR法鑒定 原代足細(xì)胞和永生化小鼠足細(xì)胞均有Podocin基因表達(dá)，而陰性對(duì)照組未檢測(cè)到該基因表達(dá)(圖3)。

圖3 PCR法檢測(cè)小鼠腎臟足細(xì)胞中Podocin表達(dá)電泳圖

1.原代培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞；2.永生化小鼠足細(xì)胞系；3.肝細(xì)胞系

3 討 論

近年來(lái)，慢性腎臟病已經(jīng)成為全球性的公共衛(wèi)生問(wèn)題，而終末期腎臟病的發(fā)病率逐年增高[5]。在導(dǎo)致腎臟損害的病因中，足細(xì)胞作為腎小球?yàn)V過(guò)屏障的最后一道閘門(mén)，其損傷會(huì)導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生[6]，進(jìn)而加重腎臟損害[7]。差異過(guò)篩法是最傳統(tǒng)的分離腎小球的方法，Krakower等[8]最先報(bào)道了分離腎小球的方法，后來(lái)在大鼠[9]和兔[10]上也成功地分離了腎小球，在此基礎(chǔ)上，Burlington等[11]改進(jìn)了該方法，減少了金屬篩對(duì)腎小球的損傷。但總體而言，差異過(guò)篩法的缺點(diǎn)是分離得到的腎小球純度較低，往往混有腎小管碎片。

為了提高腎小球的純度和數(shù)量，Takemoto等[12]首次采用免疫磁珠法分離小鼠腎小球，該方法缺點(diǎn)是費(fèi)用昂貴。在此基礎(chǔ)上，Zhao等[13]改進(jìn)了實(shí)驗(yàn)方法，利用四氯化三鐵代替免疫磁珠行體循環(huán)灌注，極大降低了實(shí)驗(yàn)成本，但是獲得的腎小球有限。有別于常規(guī)的心臟灌注，Liu等[4]采用胸主動(dòng)脈灌注，在腎臟建立局部循環(huán)，較心臟灌注的方法明顯提高了免疫磁珠的使用效率。

本研究借鑒并比較了不同的腎小球分離技術(shù)，總結(jié)了做好小鼠原代足細(xì)胞的培養(yǎng)的一些經(jīng)驗(yàn)：(1)分離腎小球建議使用免疫磁珠法，采用胸主動(dòng)脈灌注，提高免疫磁珠的使用效率；(2)在消化腎臟皮質(zhì)的時(shí)候，建議使用膠原酶，因?yàn)槟z原酶比較溫和，好掌握消化時(shí)間；(3)盡可能地提高腎小球的貼壁率，包括選擇合適的篩網(wǎng)，動(dòng)作輕柔，全程低溫操作，在最短的時(shí)間內(nèi)完成腎小球分離，使用膠原鋪板的培養(yǎng)皿來(lái)種植腎小球，為減少對(duì)貼壁的干擾在前3 d避免換液；(4)利用內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞從腎小球內(nèi)爬出時(shí)間和生長(zhǎng)特性不同[14]，在培養(yǎng)10～12 d開(kāi)始傳代。本研究結(jié)果提示，免疫磁珠法較差異過(guò)篩法能更高效地分離出高純度的小鼠腎小球。